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疼痛是一种保护身体的不愉快体验，它通过引发自卫反应来保护身体免受伤害。近年来，已有多项研究对大脑高级中枢的神经回路和分子机制进行了解析，在理解疼痛调节方面取得了突破性进展。然而大脑如何处理来自身体不同部位的痛觉信号，以及这些信号如何导致不同的感知和行为反应，这些机制尚不完全清楚。疼痛可以分为内脏痛和躯体痛两种不同的痛觉类型，它们虽然在大脑中有共同的神经区域，但引发不同的行为反应。内脏刺激会引发腹部的收缩反应，而体表刺激会导致后肢撤回或舔舐等行为，但不会引发腹部的收缩反应。尽管人们对疼痛的传递和调节已有深入了解，但关于大脑如何编码内脏和躯体刺激以产生不同感知和行为的具体机制，仍然是一个未解之谜。传统认为这两种疼痛由大脑中的两个不同系统分别进行处理：内侧疼痛系统和外侧疼痛系统。然而，缺乏实质性证据支持这种假设性的不同处理。最近的一项功能磁共振成像（functional magnetic resonance imaging, fMRI）的研究发现，内脏痛和躯体痛实际上都激活了相同的脑区，如中脑、小脑、海马体、岛叶皮层、丘脑和下丘脑等，这表明内脏痛和躯体痛的处理可能并不像之前认为的那样完全分离。因此，对于这两种疼痛在大脑中的具体识别和编码方式，还需要进一步的研究来阐明。
下丘脑室旁核（paraventricular hypothalamus, PVH）是脑中一个关键的核团，对多种生理过程起着至关重要的作用，包括内脏和躯体疼痛、恐惧、焦虑和进食。苏州大学徐广银教授团队在在Neuron杂志上发表研究论文Distinct circuits and molecular targets of the paraventricular hypothalamus decode visceral and somatic pain，认为内脏刺激和躯体刺激会在PVH中诱导不同的神经集群，从而形成对疼痛信号的特异性处理和后续行为输出。研究团队通过多项先进的技术手段验证了内脏痛和体表痛会激活PVH中不同的神经元群，这些神经元群分别投射到外侧隔核（lateral septal nucleus, LSV）和未定带（zona incerta, ZIC）的不同区域，从而分别介导内脏痛和体表痛。
图源 Neuron
摘要图
为了研究由内脏和躯体疼痛激活的神经系统在PVH中的表现，我们使用了Tet-off病毒系统并结合了c-Fos染色（图1）。研究人员将AAV2/9-c-fos-tTA和AAV2/9-TRE3g-mCherry混合注射到PVH，使小鼠接受内脏疼痛刺激，结肠扩张（colorectal distention, CRD）激活的PVH神经元群能被mCherry标记。在灌注前1.5小时，小鼠接受了VFF（von Frey filament）刺激，且VFF激活的 PVH 神经元群将被c-Fos染色标记。通过mCherry表达和c-Fos染色证明了PVH神经元群激活的分布，发现这些神经元群被内脏和体感觉疼痛同时激活。该实验的结果表明，40.68%的PVH神经元仅表达腹部疼痛引起的mCherry，36.65%仅表达体表疼痛激活的c-Fos，23.67%表达两种疼痛的mCherry和c-Fos。PVH神经元的数量在腹部和体表疼痛中没有显著差异，但mCherry和c-Fos双阳性神经元的百分比显著低于mCherry或c-Fos单阳性神经元。这表明CRD和VFF激活的PVH神经元是两个相对独立的人群，专门识别腹部疼痛和体表疼痛信号。
图1 腹腔和体表疼痛激活的神经元群在PVH中的表现
内脏和躯体疼痛激活不同的PVH神经系统，可能是由于不同的分子表达。因此，为了研究标记为CRD和VFF的PVH神经元群体的分子特征，研究人员采用了一种名为fLCM-seq的新方法。他们利用Tet-off系统结合c-Fos染色，特异性地标记了CRD和VFF激活的PVH神经元群，并通过激光捕获显微解剖技术（laser capture microdissection, LCM）以单细胞分辨率精确收获了标记为CRD、VFF和CRD和VFF共标记的细胞。随后，研究人员检查了这三组PVH神经集体的转录水平差异，计算高度可变基因并进行PCA分析。结果发现来自同一神经集体的细胞形成了明显不同的聚类，说明这三组PVH神经集体的转录水平存在显著差异；通过LCM分析获得的细胞类型，发现这三组PVH主要由谷氨酸能神经元组成，且几乎没有抑制性神经元，与之前关于PVH主要由谷氨酸类神经元组成的结论一致。通过计算差异表达基因（DEGs），研究人员发现P2rx3在CRD标记组高度特异性表达，Vipr2在VFF标记组高度特异性表达。P2X3R和VIPR2在疼痛调节过程中发挥关键作用。进一步的基因功能分析表明，CRD标记组中多个基因参与了正向调节疼痛感知的生物过程，VFF标记组中多个基因与激活腺苷酸环化酶活性相关。这些发现表明P2X3R可能特异性与脏器疼痛调节相关，VIPR2可能特异性与皮肤疼痛调节相关。
图2 PVH 神经集群中CRD标记和VFF标记的神经元群体显示出明显不同的转录谱
研究人员对P2X3R和VIPR2在CRD标记和VFF标记的PVH神经元上的表达进行了免疫荧光验证。结果表明，CRD标记的PVH神经元中61.10%表达P2X3R，而VFF标记的PVH神经元中只有1.09%表达P2X3R；VFF标记的PVH神经元中53.58%表达VIPR2，而CRD标记的PVH神经元中只有1.69%表达VIPR2。这些结果表明P2X3R和VIPR2特异性表达在CRD标记和VFF标记的PVH神经元上。此外，研究人员使用ATP或VIP传感剂，检验ATP和VIP是否在腹部疼痛或肌肉疼痛刺激下特异性释放，其结果表明，在CRD或VFF刺激下，PVH中表达ATP传感剂的神经元显示出锐利的反应，而在肌肉疼痛刺激下则没有反应。同样地，将AV2/9-hSyn-VIP1.7注射到PVH中，以评估VFF或CRD刺激期间VIP的释放，发现PVH中表达VIP传感剂的神经元在肌肉刺激下显示出显著反应，但在腹部疼痛刺激下没有反应。总之，腹部和肌肉疼痛刺激可以选择性增加ATP和VIP释放，这表明ATP-P2X3R和VIP-VIPR2通路可能是PVH如何区分性调节腹部和肌肉疼痛的机制。
图3 PVH神经集群中带有CRD和VFF标记的细胞明显地表达P2X3R和VIPR2蛋白
PVH神经群对内脏疼痛和身体疼痛的处理相对独立，通过两条发散的前向投射路径到特定下游大脑区域。使用荧光素GFP在CRD标记或VFF标记的PVH神经元中选择性表达，以便观察GFP标记的轴突终端在大脑中的分布。实验结果表明，ACC（anterior cingulate cortex，前扣带皮层）、BLA（basolateral amygdala，基底杏仁核）和CeA（entral nucleus of the amygdala，杏仁核中央核）从CRD标记和VFF标记的PVH神经元接收到类似强度的投射，而LSV和ZIC则呈现出不同的投射模式。LSV主要接收CRD标记的PVH神经元的投射，而ZIC主要接收VFF标记的PVH神经元的投射。进一步验证PVH-LSV和 PVH-ZIC电路的单神经元直接连接，其实验结果证实了这两个电路的单神经元粘蛋白质连接。双重反向跟踪策略表明，LSV和ZIC的反向标记PVH神经元的重叠率很低，仅为2.19%，这表明PVH神经元对LSV和ZIC的投射是两个不同的群体。此外，LSV和ZIC反向标记的PVH神经元与P2X3R和VIPR2的共表达情况的评估表明，P2X3R+和VIPR2+神经元的不同投射模式可能是PVH区分地处理内脏疼痛和身体疼痛行为的潜在神经机制。
图4 PVHP2X3R+神经元投射到LSV区域对CRD刺激具有特异性响应，而PVHVIPR2+神经元投射到ZIC区域对VFF刺激具有特异性响应
研究人员使用光纤光度法记录PVHP2X3R+和PVHVIPR2+神经元对内脏痛和躯体痛刺激的响应模式，发现PVHP2X3R+神经元对内脏痛刺激表现出明显的响应，而对躯体痛刺激无响应；PVHVIPR2+神经元对躯体痛刺激表现出明显的响应，而对内脏痛刺激无响应。此外，研究还发现PVHP2X3R+神经元投射到LSV对内脏痛刺激表现出明显的响应，而PVHVIPR2+神经元投射到ZIC对躯体痛刺激表现出明显的响应。这些结果表明PVHP2X3R+和PVHVIPR2+神经元群体具有不同的投射模式，分别传递内脏痛和躯体痛信号，从而调节内脏痛和躯体痛行为。研究人员对PVH神经元的电生理特性进行了进一步评估，比较了LSV投射PVH神经元和ZIC投射PVH神经元的差异，发现LSV投射PVH神经元的静息膜电位较低，动作电位阈值较高，激发频率较低，动作电位半宽度较大，而自发EPSCs频率较低，这些结果表明LSV投射PVH神经元的内在激发性较低。
研究人员通过化学遗传实验探究PVH神经元投射到LSV和ZIC的作用在内脏和躯体疼痛中的角色，发现激活CRD标记的PVH神经元投射到LSV可以增强内脏疼痛行为，而不影响躯体疼痛行为，抑制这些轴突末梢则可以减弱内脏疼痛行为；相反，激活或抑制VFF标记的PVH神经元投射到ZIC可以增强或减弱躯体疼痛行为，而不影响内脏疼痛行为。这些发现表明，CRD标记的PVH神经元投射到LSV专门调节内脏疼痛，而VFF标记的PVH神经元投射到ZIC专门调节躯体疼痛，这可能是PVH中内脏和躯体疼痛处理的神经基础。
图5 对CRD标记PVH神经群体投射到LSV特异性的操作会调节内脏疼痛，而对VFF标记PVH神经群体投射到ZIC特异性的操作会调节躯体疼痛
研究人员通过特异性敲低PVH神经元中的P2X3R和VIPR2表达，验证了P2X3R和VIPR2在PVH-LSV和PVH-ZIC神经回路中的作用。结果表明，P2X3R敲低增加了内脏痛阈值，而VIPR2敲低增加了躯体痛阈值。化学遗传激活LSV和ZIC神经元可以逆转内脏痛和躯体痛阈值的增加。这些结果提供了强有力的证据，表明P2X3R和VIPR2在PVH中分别调节内脏痛和躯体痛行为。
图6 P2X3R受体蛋白通过PVH-LSV神经回路专门调节内脏疼痛，而VIPR2受体蛋白则通过PVH-ZIC途径专门调节躯体疼痛
本研究涉及到了一组小鼠的疼痛相关的行为学实验模型。在内脏疼痛实验中，通过结直肠扩张CRD进行评估，小鼠用异氟烷轻度麻醉，然后将一个定制的弹性聚丙烯气球（2厘米，气球是由将手术手套的指头连接到输液管上制成的）插入结直肠，放置在肛门3厘米处，气球末端的输液管用压敏胶带牢固地固定在老鼠的尾巴上，以防止滑落或脱落。在结直肠扩张之前，让老鼠在单独的透明盒中适应30~60分钟。气球用血压计缓慢均匀地充气，直到老鼠出现明显的腹部收缩反应，以此确定内脏痛阈值。每只老鼠接受5次，间隔3分钟的重复结直肠扩张。所有内脏痛行为测试均采用盲法进行。在体表疼痛实验中，使用纤毛机械刺激针（von Frey filaments, VFF）诱导后肢撤回反应进行评估，为了尽量减少环境干扰，在进行体表痛行为测试前3天，让小鼠熟悉测试环境。测试前，将小鼠放入一个专门的透明盒（4.5×3.5×10.0厘米）中，底部有升高的网格，并让其适应30~60分钟。将一系列校准的Semmes-Weinstein monofilaments从0.008 - 2g的压力应用于后爪的足底表面，直到小鼠应激并退出刺激。阳性反应包括突然的爪子撤回、抽搐和舔爪。每次将每个VFF应用于后肢足底5次（每次保持3秒），其中引起3次阳性反应的VFF的最小弯曲力被认为是爪子撤回阈值。所有体表疼痛行为测试也都采用盲法进行。
该研究发现，PVH神经元可以通过不同的神经回路和分子机制分别调控内脏疼痛和体性疼痛。具体来说，PVH中的P2X3R+神经元通过投射到腹外侧隔核LSV来调控内脏疼痛,而VIPR2+神经元则通过投射到前扣带皮质ACC来调控体性疼痛。这表明PVH内存在功能分化的神经亚群,能够对不同类型的疼痛信号进行独立编码和调控。P2X3R+神经元通过释放ATP激活LSV中的神经元从而诱发内脏疼痛相关行为，而VIPR2+神经元则通过释放VIP激活ACC中的神经元从而诱发体性疼痛相关行为。这些发现揭示了PVH神经元调控不同疼痛类型的具体分子机制。
总而言之，这项研究揭示了PVH神经元在内脏疼痛和体性疼痛调控中的分子和神经回路机制，为进一步理解疼痛的中枢编码和调控提供了重要线索。未来的研究可以进一步探讨PVH神经元与其他脑区的相互作用，以及其在慢性疼痛发生发展中的作用，为疼痛的精准调控治疗提供新的靶点。
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