【第四届检验与临床（血液与体液）思维案例大赛总决赛稿件】
作者 | 钟辉秀1，章梁君1，刘伟平1，肖艰2，彭薇2
单位 | 四川省自贡市第一人民医院：1.检验科;2.血液科
外周血中中性粒细胞吞噬红细胞现象是在一种少见的现象，文献报道这种现象主要见于自身免疫性疾病或血液系统恶性肿瘤，笔者报告的这例44岁女性难治性自身免疫性溶血性贫血(AIHA)患者，外周血中也发现了大量中性粒细胞吞噬红细胞现象，但经研究证实这种现象仅发生在抗凝外周血中，在体内并没有吞噬红细胞现象，为抗凝剂依赖的中性粒细胞吞噬红细胞现象，这种现象实为罕见，为了揭示其临床价值，现对本案例进行分析报道。
患者，女，44岁，入院前1+月，无明显诱因出现皮肤黄染，尿色加深等症状，遂到本市一家三甲医院就诊，部分实验室检查结果为：Hb40g/L，MCV128.7fl，HCT0.139，网织红细胞19.13%，抗核抗体ANA阳性，抗CENP-B弱阳性，TBil84.6umol/L，DBil22.6 umol/L，IBil45.96umol/L，酸溶血试验阴性，蔗糖溶血试验阴性，Coombs试验阴性，骨髓检查未见明显异常。
予以地塞米松抑制免疫，输血及对症治疗，病情好转，诊断为“自身免疫性溶血性贫血”，患者院外长期服用“强地松50mgqd、铝镁加混悬液”治疗，半月前患者至该医院复查：Hb53g/L，TBil82.5umol/L，DBil22.9 umol/L，IBil59.6umol/L。
随后患者至上级医院进一步就诊，完善相关检查后亦诊断为“自身免疫性溶血性贫血”，并加用叶酸片2粒tid治疗，1周前患者开始出现头晕、乏力，活动后心累、气促、伴耳鸣，于2017年8月28日到本院就诊，门诊以“自身免疫性溶血性贫血”收入血液免疫科。
完善相关检查亦诊断为“自身免疫性溶血性贫血”，进行输血、激素、环磷酰胺片、血浆置换等治疗，用激素（甲强龙）治疗有效，但减量后再次出现溶血加重，9月10日、24日及28日检验科外周血涂片镜检均报告了较多中性粒细胞吞噬RBC现象，经过检验与临床的沟通，并请示上级医院专家后，给予利妥昔单抗（美罗华）100mgqw治疗以抑制（骨髓病态造血）免疫，1个疗程后患者血红蛋白逐渐上升，10月16复查血常规显示Hb90g/L，患者于2017年10月17日出院，随后在血液专科门诊就诊，其血红蛋白逐渐恢复正常，不久后患者已完全康复。
1.血常规及生化指标中总胆红素与间接胆红素结果分析
患者入院时RBC、Hb均严重降低，网织红细胞明显增高，生化指标中的总胆红素、间接胆红素均增高，提示患者为溶血性贫血。经过激素（甲强龙）治疗有效，RBC与Hb有所升高，但减量后再次出现溶血加重，Hb又降低，且较长时间维持在50g/L左右，治疗效果差，至10月23日使用利妥昔单抗（美罗华）治疗后，Hb逐渐升高，各项指标逐渐恢复正常，详见下表1~2。
表1 入院至使用美罗华治疗前的血常规及胆红素主要指标结果
表2 使用美罗华治疗至出院前的血常规及胆红素主要指标结果
2.外周血涂片检查结果分析
9月10日首次报告中性粒细胞吞噬RBC现象，于9月24日再次报告了中性粒细胞吞噬RBC现象，且中性粒细胞严重变形，粘附上多个RBC形成花瓣样或卫星样分布（见图1~4）。
并于9月28日分别用EDTA-K2抗凝管、枸橼酸钠抗凝管及肝素抗凝管采集患者血液进行血常规检测，三种抗凝标本各血常规指标无明显差异，同时分别制作血涂片镜检，均查见中性粒细胞吞噬RBC现象，且中性粒细胞也严重变形，粘附上多个RBC形成花瓣样或卫星样分布，并且观察到中性粒细胞吞噬红细胞的整个动态过程（见图1~4）；
图1抗凝血 中性粒细胞粘附RBC形成花簇样或卫星样排列
图2抗凝血 中性粒细胞正在吞噬RBC
图3 抗凝血 中性粒细胞已完全吞噬RBC
图4 抗凝血 中性粒细胞消化破坏已吞噬的RBC
而直接采指尖血制片检查显示中性粒细胞形态正常，无变形，无吞噬RBC现象（见图5），证实患者外周血中性粒细胞吞噬RBC现象为抗凝剂依赖的。再回顾性分析患者入院后的所有血涂片，均有中性粒细胞粘附及吞噬红细胞现象，并后续继续观察，结果显示随着患者治疗好转，这些现象逐渐减少，到出院时只能见到少量中性粒细胞吞噬红细胞。
图5 未抗凝末梢血 中性粒细胞无变形、无吞噬RBC
将各抗凝全血分别放置不同时间后进行制片染色，显微镜下分别计数100个中性粒细胞中吞噬了红细胞的中性粒细胞数，并计算百分比(%)，结果显示随着标本放置时间延长吞噬现象越严重（见表3）。
表3 不同抗凝剂及不同时间吞噬了RBC的中性粒细胞百分率
3.骨髓涂片细胞形态学及流式细胞免疫学（FCM）检查结果分析
红系比例极度增高（73.5%），支持溶血性贫血，骨髓中中性粒细胞形态正常无变形，无吞噬红细胞现象（见图6），提示患者体中性粒细胞并无吞噬RBC现象；FCM细胞免疫分型检查未见异常细胞，排除了血液系统恶性疾病。
图6 未抗凝骨髓 中性粒细胞无变形、无吞噬RBC
4.溶血相关检查结果分析
网织红细胞、总胆红系及间接胆红素均增高（见表1~2），直接抗人球蛋白试验、直接抗人球蛋白C3及直接抗人球蛋白IgG均为强阳性，抗核抗体IgG为1：320阳性（为着丝点型），G6PD酶、血红蛋白电泳、红细胞渗透脆性试验均正常，冷凝集素及冷热溶血试验均为阴性，PNH相关指标CD55及CD59正常，贫血指标中血清铁蛋白、叶酸及维生素B12均正常，支持患者为自身免疫性溶血性贫血。
5.其他检查
肺炎支原体IgM抗体弱阳性，乙肝两对半中HBsAg、HBeAb及HBcAb为阳性，HBV DNA定量为1.61×103 Copies/mL，其他生化及免疫学指标均正常，其他影像学检查无异常。
1、主诉和入院症状：患者44岁女性，主要症状为皮肤黄染、尿色加深，伴随贫血症状，无明显诱因。
2、既往病史：患者有自身免疫性溶血性贫血的病史，曾长期服用地塞米松等药物治疗。
3、诊断过程：患者在多家医院就诊，进行了一系列检查，包括实验室检查、骨髓检查等，最终确诊为自身免疫性溶血性贫血。
4、治疗过程：初期治疗采用地塞米松、输血及对症治疗，但病情波动较大，患者出现头晕、乏力等症状。后期给予激素（甲强龙）治疗有效，但减量后溶血加重。最终采用利妥昔单抗治疗，患者血红蛋白逐渐上升。
5、疗效评估：经过利妥昔单抗治疗一个疗程后，患者血红蛋白逐渐上升，最终达到90g/L，症状明显改善，患者于2017年10月17日出院，随后在门诊就诊，血红蛋白逐渐恢复正常，完全康复。
6、治疗方案的调整：在激素治疗效果不佳、溶血加重的情况下，根据检验与临床的沟通并请示上级医院专家，采取了利妥昔单抗治疗方案，取得了良好的疗效。
7、结论：患者的自身免疫性溶血性贫血经过充分的检查和综合治疗，最终取得了良好的疗效，达到了完全康复的目标。
综上所述，这个案例突出了自身免疫性溶血性贫血的诊断和治疗过程中的重要问题，包括多学科的综合诊疗、治疗方案的调整与个体化治疗等方面。
自身免疫性溶血性贫血(AIHA)是由自身抗体作用于红细胞(RBC)表面、结合或非结合补体并诱导红细胞破坏而引起的自身免疫性疾病[1]。外周血中中性粒细胞的吞噬RBC现象极为少见，而被证实为患者体内无吞噬、外周血中性粒细胞吞噬RBC现象为抗凝剂介导的则更为罕见。
有报道称中性粒细胞吞噬是一种外周血形态异常现象，主要见于一些溶血性贫血，如感染引起的溶血[2]、镰状细胞性贫血[3]、自身免疫性溶血性贫血[4、5]，尤其是阵发性冷性血红蛋白尿(PCH)、冷性凝集素病(CAD)[6、7]。其他疾病如白血病[8、9]、淋巴瘤也可见[10]。
本病例为温抗体型自身免疫性溶血性贫血患者，进行输血、激素、环磷酰胺片、血浆置换等治疗，用激素（甲强龙）治疗有效，但减量后再次出现溶血加重，持续治疗了5个多月，但疗效甚差，为难治性的身免疫性溶血性贫血。
本病例与以往报道的所有病例不同，患者外周血中性粒细胞吞噬现象仅发生在抗凝血中，无论是EDTA-K2、枸橼酸钠还是肝素抗凝血中均有较多中性粒细胞粘附及吞噬RBC现象，而在无抗凝剂的情况下，外周血和骨髓中都没有中性粒细胞粘附及吞噬红细胞的现象，证明在患者体内并没有中性粒细胞吞噬RBC现象，这种多种抗凝剂均可介导的中性粒细胞吞噬RBC现象未见报道。
目前其机制尚不明确，但有体外和体内研究表明[11]，当红细胞在自身免疫反应中被IgG类不完全抗体致敏后，特别是在炎症条件下，能降低IgG介导的中性粒细胞吞噬红细胞的阈值[11]，中性粒细胞可成为清除红细胞的主要吞噬细胞，本病例患者红细胞表面有大量的C3和IgG抗体，并有乙型肝炎病毒和肺炎支原体感染，这些可能都是中性粒细胞吞噬红细胞能力增强的原因，在抗凝剂的作用下，可能导致中性粒细胞趋化功能增强及超过吞噬阈值而吞噬红细胞，但这还有待进一步研究证实。
本例患者贫血、黄疸就诊，完善相关检查确诊为温抗体型自身免疫性溶血性贫血，先后到多家医院就诊，进行了输血、激素、环磷酰胺片、血浆置换等治疗，用激素（甲强龙）治疗有效，但减量后再次出现溶血加重，持续治疗了5个多月，但疗效甚差，为难治性的身免疫性溶血性贫血。
当检验人员发现外周血涂片有抗凝剂依赖的中性粒细胞吞噬红细胞现象后，反复与临床进行沟通交流，临床更换了治疗方案，采用利妥昔单抗（美罗华）以抑制（骨髓病态造血）免疫，1个疗程后患者病情逐渐好转，最终完全康复，随着治疗的有效，患者外周血中性粒细胞在抗凝剂中吞噬RBC现象也逐渐减少，所以，对这种患者采用利妥昔单抗治疗可能效果更好。
显微镜下细胞形态学检查可以为临床疾病诊治提供重要线索，检验人员要有高度责任心，及时发现诊治线索，并积极主动与临床沟通交流，帮助临床诊治。
本病例在8月28日入院时血涂片中就有中性粒细胞吞噬RBC现象，但检验人员并未发现，在9月10日才首次报告了中性粒细胞吞噬RBC现象，但未及时与临床沟通，临床也未引起重视，至到9月24日再次报告了中性粒细胞吞噬RBC现象，才首次与临床医生进行了沟通，并于9月28日证实患者体内无吞噬、外周血中性粒细胞吞噬RBC现象为抗凝剂介导的时侯，又再次与临床医生进行了沟通交流，这种现象提示患者可能是特殊免疫因素所致的自身免疫性溶血性贫血，于是，临床换用利妥昔单抗（美罗华）治疗，达到了理想的疗效。
本病例抗凝血中中性粒细胞粘附及吞噬RBC现象可能会导致红细胞和Hb的假性减少，特别是对RBC数、MCV、MCH、RDW影响更大，血常规结果显示MCV与RDW明显增高，与血涂片上RBC大小明显不符合，表明MCV与RDW是假性增高，可采用未抗凝外周血直接检测或采血后立即检测以排除干扰。本案例提示该类患者在治疗过程中应尽量避免肝素、枸橼酸等抗凝剂的使用，否则，可能会在体内引起中性粒细胞真的吞噬破坏RBC而导致病情加重。
（血液科肖艰主任医师）
该患者为自身免疫性溶血的患者，出现无法解释的红细胞计数与血红蛋白水平不呈正相关，涂片看到的红细胞大小与MCV不相符合，且在该患者的外周血涂片中看到明显的中性粒细胞粘附及吞噬红细胞的现象，对激素治疗效果不佳。
我院血液学实验室团队通过深入思考研究发现，中性粒细胞吞噬现象在体外环境中发生（患者冷凝集素及冷热溶血试验阴性，PNH检测指标正常），故特殊免疫因素所致的自身免疫性溶血性贫血可能性大。
在实验室检查结果的指导下，换用利妥昔单抗强化免疫抑制治疗，患者病情得到控制，血红蛋白恢复正常。血液学实验室钟辉秀老师团队通过对比研究，解释了实验室检查中存在的疑惑，且该现象极为罕见，特此分享，希望为各位同道在遇到类似问题时提供借鉴参考。
参考文献
[1] Penalver, F.J., et al., Rituximab is an effective and safetherapeutic alternative in adults with refractory and severeautoimmune hemolytic anemia. Ann Hematol, 2010. 89(11): p.1073-80.
[2]Salama, R., G. Girgis, andJ. Zhou, Erythrophagocytosis by neutrophils associated withClostridium perfringens-induced hemolytic anemia. Ann Hematol,2015. 94(3): p. 521-2.
[3] Mamtani, M., et al.,Erythrophagocytosis in sickle cell anemia: statistical evidencefor a biological phenomenon. Med Hypotheses, 2007. 68(5):p. 1065-70.
[4]Lee, J.H., A rare case oferythrophagocytosis by neutrophils on the peripheral blood smear.Blood Res, 2017. 52(1): p. 74-75.
[5]Lian, X., M. Guo, and J.Hao, Erythrophagocytosis by Neutrophil and Monocyte in AutoimmuneHemolytic Anemia After Infection. Indian J Hematol BloodTransfus, 2020. 36(2): p. 444-445.
[6]Mukhopadhyay, S., L.Keating, and A.K. Souid, Erythrophagocytosis in paroxysmal coldhemoglobinuria. Am J Hematol, 2003. 74(3): p. 196-7.
[7]Walia, H., et al., Coldagglutinin disease with erythrophagocytosis by neutrophils occurringduring recovery phase of chickenpox. J Lab Physicians, 2013.5(2): p. 146-7.
[8]Zhao, Y., et al.,Erythrophagocytosis by dysplastic neutrophils and theirprecursors. Int J Lab Hematol, 2023.
[9]Etzell, J., et al.,Erythrophagocytosis by dysplastic neutrophils in chronicmyelomonocytic leukemia and subsequent transformation to acutemyeloid leukemia. Am J Hematol, 2005. 79(4): p. 340-2.
[10]Keramati, M.R., et al.,Case of erythrophagocytosis in a patient with mantle cell lymphomaand cold agglutinin disease. Leuk Res, 2010. 34(7): p.e167-8.
[11]Meinderts, S.M., et al.,Human and murine splenic neutrophils are potent phagocytes ofIgG-opsonized red blood cells. Blood Adv, 2017. 1(14): p.875-886.