自上世纪90年代引入联合抗逆转录病毒疗法（ART）以来，艾滋病患者的预后已有显著改善。然而，仅在2021年，就有超过150万人新增感染，65万人死于与艾滋病有关的原因。抗逆转录病毒治疗本身带来了终身获取和坚持治疗的负担。尽管ART可以有效控制病毒复制，但HIV-1仍是稳定整合的前病毒的潜在储存库，一旦治疗停止，病毒会迅速反弹。为根除艾滋病，研究人员开发了潜伏逆转剂（LRAs），用于重新激活病毒基因表达，使免疫系统能够检测和清除受感染的细胞。尽管已确定一些有效的LRAs，但单独使用似乎无法清除感染的细胞或减小潜伏库的规模。因此，最近的临床试验尝试将LRAs与免疫清除剂或免疫疗法相结合，但目前尚未取得成功。对于这种失败，目前尚不清楚是由于LRAs在病毒抗原呈递的范围或持续时间上不足，还是对于小而弥漫的潜伏库的影响不足。
最新研究发现，潜伏期预防是一种新的方法，可以作为额外或替代的策略。过去认为长期潜伏库在感染后立即开始持续复制，但最新观察发现，实际上许多长期潜伏库是在抗逆转录病毒疗法启动前一年形成的(图1)。
图1
在持续的病毒血症或早期抗逆转录病毒治疗期间，细胞被循环的病毒种类(紫色)感染。其中一些被感染的细胞可能存活下来，逐渐进入更深层次的前驱静止期和潜伏期(红色箭头)。由于宿主细胞或病毒激活的影响，最近和较老的克隆(用逐渐变暗的颜色表示)可能会增殖并可能进入更深的潜伏期状态，或者可能会逐渐保持静止(绿色箭头)。受感染的细胞也可能由于免疫清除、病毒细胞病变效应或仅仅是宿主细胞衰老而死亡。因此，在“深潜伏”(深色圆圈)中携带病毒的细胞的频率是有限的。一旦启动抗逆转录病毒治疗，就可以预防新的感染。随着病毒血症的解决，免疫激活减弱，强制潜伏期的力量(红线)可能增强，而诱导病毒表达和退出潜伏期的力量(绿线)减弱。随着时间的推移，潜伏感染的频率达到平衡，潜伏克隆的增殖率大致与克隆清除或细胞死亡相匹配。
研究表明，在病毒血症期间，潜伏库是动态的，ART阻止了新的感染，减缓了免疫激活，并促进了免疫重建，有利于最近整合的潜伏状态前病毒的进入和持续。这一发现表明，在治疗开始时进行干预可以防止大部分储藏池的形成，并减少仍然受到ART抑制的潜伏池的规模(图2)。
图2
在ART启动之前，由于免疫激活、宿主细胞周转和较高的病毒复活率，很少有病毒处于深度潜伏状态。因此，在ART发起时间附近管理延迟预防代理(LPA)可以防止建立和实施延迟的主机改变。在ART启动后，潜伏库稳定下来，并受到潜伏期的多种分子机制的影响。特别是深潜伏的病毒，受到包括表观遗传修饰在内的多层宿主驱动机制的抑制。因此，单一的LRA可能会使病毒进入较浅的潜伏期状态(红色箭头)，而不会恢复病毒基因的表达。可能需要不同的LRA的组合，以实现广泛和临床有效的潜伏期逆转，使前病毒宿主容易受到免疫机制和治疗方法的影响，以根除持续的HIV感染。
关于调控潜伏期的基础的表观遗传学、细胞学和免疫学因素还没有完全了解，但一些针对逆转潜伏期的机制也可能适用于防止前病毒进入潜伏期，因此一些LRA方法也可能被重新评估为延迟预防替代（LPA）。
Viruses期刊发表的一项综述，简要总结了扭转潜伏期的主要策略，并探讨了新兴的研究和预防潜伏性储藏层形成的潜在方法。基于已接受抗逆转录病毒治疗的近3000万人群以及每年新增150万例HIV-1感染的人群的显示，这两种策略可能在未来的根除HIV-1感染战略中起到重要作用。对于在感染早期或在慢性HIV感染后进行诊断和治疗的人来说，减少潜伏期的持续时间是抗逆转录病毒治疗的宝贵补充。而在病毒血症期间建立潜伏期的“旧病毒”仍将存在，因此潜伏期逆转策略也可能成为未来根除感染战略的重要组成部分。
doi: 10.3390/v15081677.
病毒潜伏期：病毒在哪里？如何持续复制？
HIV-1主要感染活化的CD4+T细胞和巨噬细胞。在急性感染期间，病毒血症迅速增加，CD4+T细胞数量下降，这既是感染和细胞毒性T细胞死亡的直接结果，也是免疫过度激活和旁观者死亡的间接结果。一旦启动抗逆转录病毒治疗（ART），活跃的病毒复制就会停止。然而，一个小的潜伏库仍然存在，即被HIV-1感染的细胞群，它们在未使用活化剂或潜伏期逆转剂（LRA）治疗之前不会将病毒传播到未感染的目标细胞，但在治疗后有可能传播病毒。潜伏库是HIV-1治愈的最大障碍。潜伏病毒的转录沉默意味着它们不会表达病毒蛋白，因此很难成为治疗的靶点。
许多潜伏库是长期存在且具有自我更新能力的，它们的自然衰变速度过慢，无法在大多数HIV携带者（PLWH）的有生之年内实现病毒的清除。因此，根除潜在的储藏者需要采取具体且有针对性的方法。
CD4+T细胞群是潜伏储存库中最为重要的组成部分。
中央记忆CD4+T细胞是持续感染的主要细胞类型。其他细胞类型，如幼稚、干细胞记忆和过渡性CD4+T细胞，也可能存在潜伏感染，但感染频率较低且尚未深入研究。
除了CD4+T细胞之外，巨噬细胞和小胶质细胞也可能形成病毒库。
在各种解剖间隔中也发现了病毒RNA和/或DNA。
了解在不同类型细胞和隔室中建立和维持病毒潜伏的机制，对于有效治疗潜伏感染具有重要意义。
潜伏库的建立
CD4+T细胞群是潜伏储存库中最为关键的组成部分，其中中央记忆CD4+T细胞是持续感染的主要细胞类型。其他细胞类型和解剖间隔中也可能存在潜伏感染，但相关研究较为有限。静止状态或最低程度激活的CD4+T细胞可能直接感染潜伏库，在早期感染中可能发挥重要作用。静止的CD4+T细胞在逆转录过程中的效率较低，但在激活后可释放病毒。此外，静止的CD4+T细胞可以通过细胞间传播感染，可能导致立即建立潜伏状态。了解不同类型细胞和解剖间隔中的病毒潜伏机制对于治疗潜伏感染具有重要意义。
潜伏期建立的动态是一个重要的争论主题，尤其是在CD4+T细胞。过去的模型认为，HIV-1在感染后不久就进入潜伏状态，并且即使开始抗逆转录病毒治疗，潜伏池仍会形成。因此，根除潜在的储存库的努力主要集中在扭转潜伏状态。然而，最近的研究表明，大多数长期潜伏池与ART启动前后传播的病毒之间存在密切关系，这对现有的潜伏期建立模型提出了挑战。此外，研究还提出了一种机制，即ART可以改变病毒进入和退出潜伏状态的速度。进入和退出潜伏状态以相对恒定的速度进行，进入主要由新细胞感染驱动，而退出则是由免疫激活引起的。因此，潜伏库通过最近感染的细胞持续播种，但这些细胞在有限的时间内保持潜伏状态。
ART治疗启动后，新的感染被阻止，但退出潜伏状态的机制减少。另一个解释是，ART阻止了同一细胞的额外感染，也就是重复感染。在ART之前，少数存活的细胞可能不表达病毒基因，并且对第二次感染特别敏感；一旦启动ART，重复感染停止，使尚未倍增感染的潜伏感染细胞部分能够持续存在。
潜伏期的分子机制
HIV-1潜伏期的特点是病毒基因转录极少或没有。在休眠细胞中，由于缺乏启动子-近端停顿所需的转录因子，潜伏状态得以保持。在静息细胞中，转录因子被隔离在细胞质中，导致病毒转录无法被激活。此外，正转录延长因子b（p-TEFb）的信号传递被中断，导致RNA聚合酶II启动复合体保持停滞状态或过早终止转录。此外，转录干扰也是实现潜伏期的一种机制，当病毒整合到宿主基因中时，RNA聚合酶II会读取病毒的长端重复序列（LTR），从而影响病毒基因表达。
在HIV潜伏期的建立和维持中，表观遗传机制起着重要作用。这些机制涉及核小体定位和招募抑制性表观遗传修饰。在潜伏期，病毒LTR与两个核小体结合，阻碍了转录的启动。当宿主转录因子被释放到细胞核中时，病毒可以重新激活，促进染色质重塑，从而恢复转录因子对病毒启动子的访问。此外，病毒LTR的高甲基化也与基因表达的抑制相对应。其他有助于前病毒沉默的表观遗传障碍包括组蛋白去乙酰化酶和组蛋白甲基转移酶的招募，从而形成抑制性染色质结构。前病毒重新激活的特征是甲基化标记减少和乙酰化增加。因此，乙酰化状态和去乙酰化状态之间的转换对潜在储存库的形成至关重要。
转录后调控因子在调节HIV潜伏期方面可能发挥作用。病毒基因的表达需要对病毒RNA进行加工，包括封端修饰、腺苷酸化和甲基化等过程。此外，HIV病毒RNA还需要经过选择性剪接才能产生完整的病毒蛋白。如果这些过程中有任何一环未完成，可能导致病毒进入潜伏状态。研究表明，宿主蛋白在RNA处理和代谢方面的参与可能会延长病毒的潜伏期。有研究发现，潜伏感染的细胞在产生多剪接HIV RNA方面存在可逆的阻碍作用。
显然，病毒潜伏期的建立和维持受多种因素的调控，这些因素影响病毒基因的表达和病毒颗粒的产生，包括染色质可及性、转录起始和延伸、以及转录后加工和翻译等。以下各节总结了使用潜伏期逆转剂（LRA）针对这些因素以促进病毒基因表达的研究进展，并讨论了针对其中一些因素以防止潜伏期建立的新方法。
根除艾滋病毒潜伏宿主的战略：潜伏期反转录替代策略
1.早期延迟逆转录
逆转潜伏期的方法包括广泛激活T细胞和针对转录和表观遗传机制的方法。然而，广泛激活T细胞的方法未能有效减少潜在的病毒储存库，并且存在着毒性风险。因此，研究的重点转向了针对转录和表观遗传机制的方法，以抑制病毒基因表达。这些方法包括使用表观遗传调节剂、宿主转录激活剂和免疫调节化合物。这些策略旨在干扰病毒的转录过程和表观遗传修饰，从而有效地控制病毒基因的表达。
2.表观遗传LRA
研究人员发现，通过抑制LSF（转录因子）结合和HDAC1（组蛋白去乙酰化酶1）的募集，可以逆转HIV感染者CD4+T细胞中病毒的潜伏状态。HDAC抑制剂已经在治疗T细胞淋巴瘤方面得到批准使用，这引起了人们对HDAC抑制剂在治疗HIV感染中的潜力的兴趣。
3.针对HDACI结构类别的治疗
针对HIV潜伏感染的治疗方法包括脂肪酸类、异羟肟酸、苯甲酰胺等化合物，以及HDACi涡旋剂和DNA甲基转移酶抑制剂等药物。这些药物能够逆转细胞中的潜伏期HIV转录，并提高病毒基因表达水平。然而，仅通过潜伏期逆转并没有观察到潜伏感染细胞频率的降低。此外，使用表没食子儿茶素没食子酸酯抑制泛素样蛋白与PHD和环指结构域1也可以增加CA-US HIV-1RNA水平。这些研究为HIV潜伏感染的治疗提供了一些新的方向。
4.宿主转录激活因子
核因子-kB在激活病毒基因表达方面发挥着重要作用，因此是潜在的潜伏期逆转剂（LRA）的靶点。核转录因子-kB家族包括P50、P52、RelA、RELb和c-Rel。典型途径可以迅速激活不同基因的表达，而非典型途径则更缓慢但更持久地激活核因子-kB2和RelB。以往的临床试验中，蛋白激酶C（PKC）激动剂被用于通过典型途径激活NF-kB，但未能产生预期效果且有毒性。然而，双硫兰是一种替代方案，它可以促进核因子-Kb1和RelA进入细胞核，但对病毒转录的影响较小甚至没有影响，并且不会减少存储库的容量。
转录因子的活化范围较窄，因此针对非规范的核因子-kB途径可能具有更高的特异性和较低的毒性。非规范途径可以通过受体连接激活，也可以在途径的中间步骤被激活，例如通过增强半胱氨酸酶激活剂（SMAC）的活性。SMAC类似物在促进肿瘤细胞凋亡方面显示出潜力，并且已在体外和动物模型中显示出诱导基因转录的作用。SMAC模拟物AZD5582在抑制HIV和SIV感染的动物模型中诱导病毒基因的表达。尽管非规范的核因子-kB途径激动剂尚未减少CD4+T细胞潜伏储备库，但它们可能是比其他候选药物更为特异的方法。
5.免疫调节化合物
免疫调节化合物具有双重益处，可以促进病毒基因的表达，恢复免疫功能，并消除受感染的细胞。在其中，TLR7激动剂在猕猴的SIV模型中显示出良好的效果，但其结果尚未得到其他研究组的复现。对于TLR9配体MGN1703的潜力，仍需要进一步的研究。目前，针对TLR3、7和9的治疗方法对于CD4+T细胞的影响是间接的。此外，细胞质模式识别受体的潜力也正在进一步探索中。
靶向免疫检查点抑制物（ICIS）是一种逆转HIV潜伏期的免疫调节方法。HIV感染会导致免疫功能紊乱，包括共抑制受体的过度表达和HIV特异性CD8+T细胞的功能衰竭。通过阻断共抑制受体，可以逆转病毒的潜伏状态并恢复免疫功能。ICIS最初是为治疗恶性肿瘤而开发的，但在艾滋病毒携带者和癌症患者的研究中也取得了一些进展。一些抗体治疗显示对病毒血症有影响，但也伴随着与自身免疫相关的不良反应。
慢性感染会导致免疫激活和细胞衰老。衰老细胞可成为治疗的目标，mTOR抑制剂和PKC激动剂可以减少促炎细胞因子的产生。在使用T细胞激活剂时添加mTOR或Janus激酶抑制剂可以降低毒性，恢复广泛激活T细胞的可能性。除此之外，还有其他免疫调节方法，例如使用IL-7或IL-15刺激细胞免疫，不过毒性较小，已开展的一些临床试验显示IL-7和IL-15在治疗HIV感染方面的效果有限。
潜伏期预防替代：一个新概念
潜伏期逆转和潜伏期预防一直是重要的研究课题。近年来，潜伏期预防的概念才开始引起关注。研究表明，大多数循环潜伏库是在ART（抗逆转录病毒治疗）启动前后形成的。目前关于进入潜伏期的调控机制还不够清晰。然而，由于正在积极转录的前病毒还没有受到多层转录和表观遗传沉默的影响，因此在体内预防潜伏期可能比逆转潜伏期更具有效性。最近的研究模型显示，前病毒对潜伏期预防策略的影响非常敏感，因此希望在ART启动时采取的有限时间干预措施可以与临床监测相结合。根据最新的研究和潜伏期逆转研究，已经提出了几种方法。
1.靶向前驱表现遗传机制
最新研究表明，在治疗HIV-1潜伏期的细胞模型中，只有I类HDAC能够维持病毒基因的表达。持续的病毒基因表达与病毒启动子区域的某些化学修饰有关。HDAC通过去除组蛋白尾部的乙酰基，清除了表观遗传修饰的沉积，从而促进病毒进入更深的潜伏期。此外，HDAC还对CD4+T细胞的记忆和寿命发挥重要作用。基于这些研究结果，给予I类HDAC抑制剂可能有助于缩小HIV潜伏库的规模。目前已有两项临床试验在艾滋病毒感染早期进行了抗逆转录病毒治疗，但尚无法确定HDACi对潜伏感染频率的影响。美国国立卫生研究院正在进行一项临床试验，以测试涡流调节剂对潜伏感染频率的影响。
2.靶向CD4T细胞生物学：IL-7/IL-7R信号传导阻断
第二种潜伏期逆转方法主要基于急性HIV感染对CD4+T细胞的影响，ART治疗可以恢复这种影响。在未经治疗的感染期间，免疫功能失调和病毒复制导致免疫激活，减少长寿命记忆CD4+T细胞的形成。ART治疗后，病毒血症和免疫激活减少，恢复了稳态的IL-7/IL-7R水平，使得效应器细胞向记忆细胞的转变恢复，增加了潜伏病毒的长期记忆细胞库。因此，在ART启动期间阻断IL-7/IL-7R信号可能是一种可行的策略，可以减少CD4+T细胞内潜伏病毒库的大小。对抗IL-7R的单克隆抗体在其他疾病研究中已经取得了一些进展，并在健康个体中表现出良好的效果。
治疗挑战
1.LRA面临的挑战
潜伏期逆转的挑战在于细胞和组织间的异质性，这给研究带来了重大的困难。每个隔室都存在着独特的药理学难题，单一的方法很难针对多种细胞和隔间中的病毒潜伏期。为了应对复杂的转录沉默机制，可能需要使用多种药物的组合。结合潜伏期逆转活性适中的LRA与免疫疗法可能是减少潜在储存库的有效方法。目前已经进行了LRA与免疫清除剂的组合临床试验，但在减少储存库大小方面尚未取得成功。
2.LPA面临的挑战
LPA研究可能会面临与LRA相同的挑战，需要采取多种不同机制的方法。LPA策略的独特之处在于不会直接针对已经存在的潜伏库。大部分潜伏库形成于外周血中的CD4+T细胞，尚不清楚在其他细胞和组织中是否存在类似的潜伏库，需要进一步研究。
总 结
抗逆转录病毒疗法（ART）极大地改善了HIV-1感染者的预后，但治愈方法仍然难以捉摸。治愈的最大障碍是存在一个长期潜伏的储存库，该储存库持续存在于不同细胞类型和解剖隔间的异质混合中。根除潜在储存库的努力主要集中在潜伏期逆转策略上。然而，最新研究表明，大多数长期潜伏的储存库是在ART启动时建立的，这表明有可能将干预措施与ART启动相结合，以防止相当大一部分潜伏储存库的形成。随后使用潜伏期逆转剂，结合免疫清除剂，可能是一种更易处理的策略，可以完全清除新开始抗逆转录病毒治疗的个体的潜伏库。在这里，我们总结了潜伏期建立和维持的分子机制，正在进行的开发有效潜伏期逆转剂的努力，以及设计潜伏期预防剂的最新研究进展。深入理解潜伏期建立和维持所涉及的分子机制，将有助于开发新的潜伏期预防和逆转方法，最终实现潜伏期的根除。
最近的研究在理解HIV潜伏期维持机制方面取得了重大进展，特别是在CD4+T细胞中。已经确定了一些在恢复病毒基因表达和控制病毒血症方面具有中等疗效的策略。然而，目前还没有成功缩小HIV潜伏库的策略。正在进行的研究集中于研究潜伏相关的多层调控机制、多种细胞类型和隔室的相互作用，以及潜伏相关药物与免疫清除剂的组合。未来的研究需要更深入地了解在ART开始时不同隔室中潜伏库的动力学，并发展新的观察工具来研究受感染细胞的单细胞水平。这些工作将有助于识别和评估新的药物，从而减少潜伏的规模，并最终实现HIV-1的治愈。
参考文献：Lewis CA, Margolis DM, Browne EP. New Concepts in Therapeutic Manipulation of HIV-1 Transcription and Latency: Latency Reversal versus Latency Prevention. Viruses. 2023 Jul 31;15(8):1677. doi: 10.3390/v15081677. PMID: 37632019; PMCID: PMC10459382