【导读】使用诱导多能干细胞（iPSC）衍生的神经元（iNs）对疾病进行建模，需要能够生成可预测神经元类型的明确、稳健且可重复的方案。此外，广泛的分析对于评估iN是否适合建模具有所需分子、功能和成熟相关特征的特定疾病至关重要。团队试图建立一个标准化的协议，来大规模生成iN。团队还寻求开发系统的分析数据和检测方法，以确定iN培养物的成熟水平。
2024年9月9日， 基因泰克公司Claire G. Jeong团队在期刊《Cell Reports》上发表了题为“Fully defined NGN2 neuron protocol reveals diverse signatures of neuronal maturation”的研究论文。在这项研究中，团队提出了一种利用克隆、靶向工程iPSC系和确定的试剂，生成神经元的标准化方法。团队证明了大规模兴奋性神经元的持续产生和至少150天的长期维持。团队还展示了这些神经元中疾病相关基因的表达，以证明协议与模拟神经系统疾病的相关性。最后，团队展示了NGN2整合的iPSC系的高效生成。这些工作流程、分析数据和功能表征，使神经系统疾病的可重复人类体外模型的开发，成为可能。
研究背景
01
诱导多能干细胞（iPSC）衍生的神经元（iNs）是建模人类神经系统疾病的宝贵工具。目前，广泛采用两种方法来生成iNs。经典的定向分化（DD）方法，旨在概括神经发生的已知信号线索，并可以确定神经元的特定区域身份。然而，这种方法通常需要数周时间，才能产生定型和功能正常的神经元，并且对技术要求很高。此外，分化的细胞群通常包含脱靶抑制性神经元和星形胶质细胞群，其比例在很大程度上取决于iPSC系的内在特性。
最近，转录因子过表达方法在快速生成目标细胞类型方面，越来越受欢迎。NEUROG2过表达（NGN2）在1周内驱动iPSCs，进入兴奋性神经元命运。与DD相比，这种方法速度更快，需要的技术专业知识更少。
自从首个发布的方法以来，NGN2 iN方案在可重复性和靶细胞类型方面，有所提高。早期方案使用慢病毒引入多西环素（dox）诱导型NGN2转基因，这有可能产生基因组畸变和批次间变异。此外，在需要数十亿个神经元的大规模筛选中，慢病毒可能成为规模和设施可及性的限制因素。为了克服这个问题，最近的方案采用了具有诱导型NGN2的细胞系，该细胞系被设计成iPSC系的安全港位点。细胞系的克隆性，降低了批次间的差异性。通过在神经诱导过程中掺入DD因子，来实现更均匀和靶向的神经元类型，从而进行了后续改进。
除了神经诱导之外，iN成熟方案还可以进一步改进。大多数方案需要与星形胶质细胞共培养，以促进神经元成熟和活性。这引入了可变性，并且通常会抵消NGN2方案在生成相对均匀细胞类型方面的优势。此外，与星形胶质细胞共培养，增加了下游分析的复杂性。
在分析数据方面，大多数已发表的数据，集中在早期NGN2 iN（直到分化的第4周）。这可能使评估方案是否适合需要更成熟神经元的研究，变得困难。
对iPSC衍生的神经元成熟状态的了解不足，也是由于缺乏完善的成熟标志物和检测方法。以前的研究，使用一个或多个基因的表达水平，来筛选成熟的iNs。这些基因虽然可能表明神经元成熟的某些方面，但可能并不包括成熟的整个概念，例如，离子通道掺入、细胞骨架重组，以及细胞间和细胞外基质（ECM）相互作用。
在这项研究中，团队结合了上述最新进展，并解决了剩余的关键技术问题，以大规模生成长期稳定的谷氨酸能NGN2 iN培养物。团队彻底分析了实验细胞，直到第56天，以提供参考数据。通过使用分析数据，团队开发了神经元成熟测定法，并确定了使用这些NGN2 iN建模神经系统疾病的适用性。最后，团队报告了一种方案，用于设计类似于这项研究中使用的商业品系的诱导型NGN2 iPSC系。总之，这项研究为开发强大的神经系统疾病体外模型，提供了强大的工具。
图形摘要
研究进展
02
NGN2 iN适用于对各种神经系统疾病进行建模
为了探索NGN2 iN作为神经发育和神经退行性疾病体外人体模型的用途，团队从GWAS目录和SFARI中，编制了一份阿尔茨海默病（AD） 、帕金森病（PD）和自闭症谱系障碍（ASD）的全基因组关联研究（GWAS）基因列表。然后，团队在批量RNA-seq 数据（第14-56天）中检查了这些基因的表达，发现3,163个GWAS基因中，有2,374个（75.1%）在至少1个时间点，在NGN2 iN中表达（nRPKM>2），1,403个基因（44.4%）在log nRPKM>2中高度表达。团队进一步检查了第28天snRNA-seq数据中，与AD 、 PD和ASD相关的常见基因 （APOE、MAPT、APP、SNCA、PRKN、CHD8、MECP2、FMR1、SETD5），发现表达疾病基因的细胞分布在所有簇中。这些观察结果，支持NGN2 iN可能适用于研究与各种神经发育和神经退行性疾病相关的基因的观点。
在与成熟天数显著相关的模块中，3个模块（黑色、绿松石色、浅青色）显著富集ASD GWAS基因（分别为FDR 1.14e-18、1.59e-20、9.36e-4），表明这些iN可以模拟神经元发育。117个MS-117基因中，有110个在绿松石模块中富集。这些结果进一步表明，MS-117是神经元成熟的相关指标。
神经退行性疾病建模，可能需要成人水平的神经元成熟度。例如，TAU的4R剪接变体与各种形式的tau蛋白病有关。然而，目前的大多数iN模型，类似于胚胎神经元，只表达TAU的0N3R变体。目前使用iPSC研究4R亚型相关tau蛋白病的策略，通常会引入突变，来操纵TAU剪接。在团队的NGN2 iN中，可以在第150天观察到TAU的所有成体亚型，尽管4R/3R比率没有达到1：1的成人水平。这表明，随着成熟时间的延长和无基因组操作，团队的NGN2 iN，可用于研究4R TAU相关的tau蛋白病。
NGN2神经元可能适用于疾病建模
简化的基因编辑工作流程，用于设计可诱导型NGN2 iPSC细胞系
在疾病建模的情况下，PSC细胞系通常来自患者或已经被改造成现有细胞系的疾病相关突变。为了便于研究人员在他们现有的iPSC上应用该方案，团队开发了一种策略，以有效地将dox诱导型NGN2，整合到AAVS1安全港位点。团队选择了Kof2.1-J iPSC系和CRISPR核糖核蛋白（RNP）方法，进行工程设计。在供体设计中，团队分别在左右同源臂附近，包括一个mScarlet和一个杀稻瘟菌素抗性（BlastR）基因，这有助于通过杀稻瘟菌素选择和目视检查丰富同源定向修复（HDR）。团队还整合了一个错配的向导RNA（gRNA）靶向序列，以便靶向AAVS1的相同gRNA，也使供体质粒线性化，从而提高整合率。考虑到BlastR或mScarlet可能会干扰下游应用，团队在它们的两侧放置了FRT（翻转酶识别靶标）或LoxP对。
团队进一步简化了工作流程，丰富了HDR事件，并减少了要筛选的菌落数量。团队采用了高细胞密度，来提高核转染后的存活率，采用32°C冷休克和HDR增强剂混合物，来促进HDR，以及瞬时杀稻瘟菌素选择（第2-4天），以富集转染细胞。使用这种方法，团队确认了仅在16个挑选的克隆中的10个靶向编辑。
为了减少花在扩增、储存和筛选克隆上的时间和下游劳动力，团队将菌落扩增步骤与基因分型+“表型”步骤相结合。其中，从单个菌落中挑选的团块被分成3个部分，每个部分由3到4个块组成。1/3的蜂群被镀金用于蜂群扩张。将第二个1/3接种在NGN2诱导第0天的培养基中，以确认神经诱导（表型分析）。裂解剩余细胞，进行基因分型PCR。这确保了当菌落准备好再次传代时，已经确定了所需的克隆。
NGN2 iN成熟的功能特征
03
总之，团队证明了编辑工作流程能够快速、有效地，从现有iPSC细胞系，生成克隆性NGN2细胞系。与团队的NGN2 iN协议一起，这种工程方法可以成为开发疾病模型的有用工具。
1.Burke, E.E. ∙ Chenoweth, J.G. ∙ Shin, J.H. ...
Dissecting transcriptomic signatures of neuronal differentiation and maturation using iPSCs
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CORTECON: a temporal transcriptome analysis of in vitro human cerebral cortex development from human embryonic stem cells
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