iMeta | 东北林业大学冯富娟组发现丛枝菌根真菌诱导削弱镉的迁移

丛枝菌根真菌介导根际界面微生物重组削弱镉的迁移动力

全球范围内，镉污染的农业土壤普遍存在，丛枝菌根真菌(AMF)可以减少植物对重金属的吸收，改善矿质营养。然而，根际对镉的固定作用往往被忽视。以摩西球囊霉(Glomus mosseae)和紫花苜蓿(Medicago sativa)为共生体，分析了Cd在根际的迁移和环境特性。AMF减少了Cd的迁移，Cd²⁺转变为有机结合态。AMF共生处理和Cd暴露导致微生物群落变化，表现出明显的确定性过程(|βNTI| > 2)，最终形成抗重金属和营养循环的核心菌群功能。AMF增加了根际土壤有效氮和磷、胞外酶活性、有机质含量和氧化还原电位，与减少Cd迁移显著相关(P < 0.05)。此外，AMF通过上调739种代谢物显著影响根代谢，其中黄酮类化合物是导致微生物组变异的主要因素。结构方程模型(SEM)和方差偏分析(VPA)分析表明，根代谢物、微生物和土壤的叠加对Cd迁移减少的解释率最高(42.4%)，微生物模型的单一解释率最高(15.5%)。因此，根际微环境中的AMF可以调节代谢物-土壤-微生物的相互作用，减少镉的迁移。综上所述，该研究为AMF如何提高植物抗Cd性提供了新的科学解释，并提供了一种有益于环境和人类健康的可持续解决方案。

引  言

镉由于其较长的半衰期残留在土壤中无法降解，极其容易被作物吸收，威胁人类健康。据联合国环境规划署(USPEA)的数据表明，农用土壤重金属镉污染面积逐年上升，且被列为全球性意义危害化学物质之首。由于全球的耕地资源有限，提高作物抗性的同时，设法降低对污染物的吸收与积累是污染区农业关注的重要问题。而众多研究发现，人工接种调控植物抗性及重金属转运功能的微生物是解决上述问题的经济、环保的有效措施。丛枝菌根真菌(AMF)是广泛存在于自然界中且可以和90%以上陆生植物共生的根际微生物，即使在高度污染的土壤中也可以建立共生关系，具有平衡调控根际环境的重要作用。AMF，一方面可以改善植物矿质营养，另一方面可以降低植物对重金属的吸收、累积。团队前期的一项研究发现，接种 AMF 后镉敏感植物紫花苜蓿的抗性大大提高，还能能够有效降低Cd从土壤中向地上器官的转运和富集，而接种AMF后紫花苜蓿的根系生物量显著提高，但植物摄取的 Cd 总量并没有显著增加，我们推测，AMF 对宿主植物根际微生态特征的调控阻止了根系对Cd的吸收，这也是植物抗Cd的“第一道防线”。

植物对 Cd 吸收主要发生在根际区域，而其中生存的微生物群组是实现上述防线的关键枢纽。其不仅作为土壤物质循环及转换的主要驱动者，也是影响Cd 生物有效性的重要生物因素。根际微生物群落代谢功能的变化，不但会引起包括土壤原位属性（团粒结构、含水量、有机质、Eh、pH等）的变化影响Cd的生物有效性，还可能通过驱动微生物群落的重塑引发微生物核心功能的向重金属抗性方向的变异，而这一过程与关键分类群(Keystone)的种类与功能密切相关。AMF对植物根际微生物群落的重塑作用虽已被研究证实，但其调控途径及关键信号尚未明晰。但一致的观点认为实现这一调控方式的关键媒介是根际分泌物成分及含量的变化。植物根系分泌物作为信号维持着植物与微生物之间的互作，而接种 AMF 后会引起宿主植物根系分泌物的变化，其通过加速植物有机氧化物、维生素、多酚和植物激素、黄酮等代谢产物的合成，引发根系分泌物成分及含量的变化，而这正是引发微生物群落变化的主要原因。但由于根系分泌物成分的复杂性，寻找影响根际微生物构建的关键组分一直是研究的难点。因此根际“黑箱”中土壤、根系代谢物、微生物三个多变量子集之间复杂的关系路径尚未明晰。

根际微生物生物量和活性较高，使这一植根界面成为碳和养分循环的重要热点。而以往的标准化实验流程中，土壤微生物多样性或酶活性均是将土壤均质化后进行测定，这不仅忽视热点区与非热点区微生物活性的差异，还对根际原位微生物的环境造成极大扰动，造成较大的实验偏差。而采用根箱法能够原位获取根际土，不仅真正实现对“微生物热点”（Microbial  hotspots）的无扰动取样，还可以原位展示根际金属的迁移特征。本研究以前期筛选获得的农田土壤中高频出现且丰度较高的摩西球囊霉（Glomus mosseae）为供试 AMF 菌种，以紫花苜蓿为指示植物，两者建立共生体系后，采用团队自主研发的“根箱-Cd2+膜印迹联合测定法”，原位分析根际微域环境Cd化学态及有效性，比较AMF接种对镉胁迫下根代谢组学、根际土壤理化性质及微生物特征的变化。总的来说，我们旨在解决以下问题:(1)AMF是否通过调节根际微域环境降低 Cd的生物有效性；(2)根际代谢物在根际土壤微生物群落的系统发育过程中起什么作用，引发微生物群落重塑的“信号物质(代谢物)”是什么？(3) AMF 如何调控根际微环境中根系代谢物-土壤-微生物的互作关系来降低植物对 Cd 的吸收。研究结果从植物和微生物生态互作的角度为 AMF 如何提高植物耐 Cd 性提供了新的科学解释。

结  果

根际区间镉吸收热点的消失及镉有效态的变化

如图1A所示，紫花苜蓿苜蓿移栽到根箱的0-20天之间，土壤Cd分布表现出从均匀分布、逐渐下沉、到分布范围缩小的趋势。第27天，Cd逐渐呈现出沿植物根系分布的规律，第33天时，在根系周围出现了Cd的聚集热点(红色区域，单位像素Cd > 4.05mg/kg)。但与Cd处理组相比，AMCd实验组的Cd热点区域百分比明显减少(图1B)。Cd²⁺荧光定位扫描结果提供了有力证据 (图1C)，即AMCd像素位点频数分布中位数小于Cd处理组，且大于4mg/kg的像素位点占比显著低于Cd处理 (热点区) (P<0.05)。不仅如此，基于Mantel test的共定位分析也发现（根系扫描谱与Cd²⁺荧光分布谱），Cd处理组中Cd²⁺在根部的聚集度（R=0.21，P=0.032）显著高于AMCd处理组（R=0.17，P=0.041）。Cd含量测定结果也与之相符，Cd处理组根周围Cd平均浓度高达4.23 mg/kg，而AM+Cd处理组则下降至3.92 mg/kg (P<0.05) (图1D)。此外，进一步分析二者Cd组成形态发现，AMCd组可交换态Cd (强迁移性) 的含量明显低于Cd处理组 (P<0.05)，且下降接近1/3，但有机结合态Cd (弱迁移性) 显著上升 (P<0.05)，这证明了AMF可以促使Cd²⁺移动能力的下降。显然，接种后根际的微生态特征发生了重要变化，改变了镉形态，钝化了根系吸收。

图1. Cd和AMCd处理下Cd在根际的迁移和化学状态

（A）Cd处理0 ~ 33 d各组根盒Cd荧光印迹的变化。(B) Cd暴露33 d后，对Cd暴露组和AMCd处理组的根际进行Cd荧光印迹。(C) Cd和AMCd处理组荧光像素点扫描值的频率分布及基于Mantel试验的共定位分析。(D) Cd暴露和AMCd处理根际土壤Cd含量。(E)镉暴露和AMCd处理对根际土壤镉化学状态的影响。(F) Cd化学态与Cd迁移特征(热点百分比)的Spearman相关分析。每个指标进行5次生物重复，误差条为标准误差。*表示显著差异 (p < 0.05)。**表示显著差异(p < 0.01)。***表示显著差异 (p < 0.001)。

根际土壤细菌群落的变化

图2. 苜蓿根际土壤细菌群落组成及多样性（α和β）

（A）四种处理下所有土壤样品中检测到的细菌基因组箱的最大似然系统发育树和优势门（前10门）的相对丰度。（B）四种处理下土壤细菌的门和属水平。（C）根际土壤细菌Shannon、Simpson、Chao1指数和OTUs。（D）基于bray - Curtis距离和基于ANOSIM的Bonferroni的根际土壤细菌群落非度量多维尺度排序。（E）在收集的根际土壤样品中，确定性和随机过程对群落聚集的贡献。βNTI计算各处理之间的系统发育周转。（F）四种处理中每个群落聚集过程的相对影响由每个过程所支配的场地对的百分比来定义。每个指标进行5次生物重复，误差条为标准误差。*表示显著差异 (p < 0.05)。**表示显著差异 (p < 0.01)。***表示显著差异(p < 0.001)。

细菌生物标识物与关键种（keystone）

图3. 紫花苜蓿根际土壤细菌群落重点及功能预测

（A）基于LEfSe分析的不同处理的细菌生物标志物。不同的颜色代表不同的处理，圆圈从内到外对应门和属。Kruskal-Wallis检验分析表明，在进化图中以颜色编码的分类群在处理中具有显著较高的相对丰度。p < 0.05和对数LDA评分大于3.5，相对丰度小于0.1%的属未包括在内。(B)根据Welchs’ t检验，CK组与Cd组、Cd组与AMCd组的主要细菌(属水平)差异显著。(C)基于CK与Cd、Cd与AMCd组之间Bray-Curtis差异指数分解的相似性百分比(SIMPER)分析。(D)四种处理中微生物共生的视觉网络和拓扑统计。(E) 4个处理下PICRUSt2对土壤细菌功能注释的相对丰度聚类分析。(F)根据PICRUSt2功能注释，选择Cd和AMCd处理组中与重金属(污染物抗性)相关的49种细菌，并对其相对丰度进行排序。

AMF招募能够钝化重金属的细菌

土壤因子与镉热点降低的关系

如图S4所示，与CK相比，Cd处理组根际土壤的速效养分（N、P、K）含量显著降低（p < 0.05），其中NH4-N含量下降近40%（p < 0.05），但EOC和GRSP含量明显升高（p < 0.05）。而与Cd处理相比，AMCd处理组速效N（包含NH4-N、NO3-N）、速效K、TOC、EOC、GRSP和MBC含量明显升高（p < 0.05）。这说明AMF可以提高根际土壤养分利用率。此外，根际土壤胞外酶活性出现也明显变化。如图S5所示，相较于CK，Cd处理下显著降低了根际土壤N、P循环过程相关酶的活性（包括酸性磷酸酶、漆酶、脲酶、酚氧化酶、固氮酶, p < 0.05），但C循环过程相关酶显著提高（β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、亮氨酸氨基肽酶、荧光素二乙酸酶和木质素过氧化物酶，p < 0.05）。而与Cd相比，AMCd处理组中N、P循环过程相关酶的活性（包括酸性磷酸酶、漆酶、脲酶、酚氧化酶和固氮酶, p < 0.05），而上述C循环过程相关酶中β-葡聚糖酶、荧光素二乙酸酶和木质素过氧化物酶有所降低（p < 0.05），但均高于CK水平（p < 0.05）。说明AMF通过提高胞外酶活性提高土壤养分利用效率（图S6）。利用Mantel test和Spearman相关性模型，以‘Cd-土壤属性-微生物’为主轴筛选与Cd钝化相关的土壤因子与微生物类群（阈值：r > 0.6, p < 0.05）。如图4A所示，酸性磷酸酶、脲酶、NO3-N、NH4-N、速效P、β-葡聚糖酶和酚氧化酶可能是潜在参与Cd钝化过程的主要因素，而上述因素的变化与微生物显著相关（图4B），因此挑选出与上述6个因素显著相关的微生物类群 (图4C), 发现多数由Acidobacteriota、Actinobacteriota、Bacteroidota、Firmicutes、 Gemmatimonadota、Patescibacteria、Proteobacteria、Verrucomicrobiota构成，且AM处理是上述类群丰度明显增加（Cd vs AMCd），其中约63%的细菌类群上述HM - Remover一致 (图4D)。说明微生物可以通过改变土壤性质及胞外酶活性降低Cd的迁移。

图4. 以“Cd-土壤-细菌”为主轴，研究了根际土壤与细菌的相互作用

(A) Cd -土壤性质和细菌-土壤性质两次Mantel试验 (p < 0.05)。(B)细菌与土壤因子的Spearman相关模型，两者均具有Cd钝化能力。*表示显著相关 (p < 0.05)。(C)在所选细菌的门和属水平上进行计数，比较AM-和非AM处理组的相对丰度。(D)基于Bray-Curtis距离的群落相似性测试，可以影响Cd特性并同时影响Cd和土壤的细菌群。

根代谢物的变化及其对根际微生态的影响

根代谢物质的组成在不同处理下表现显著差异 (P<0.05, 图S7A)，其中Cd vs AMCd处理组差异最大 (包含301种差异代谢物)，AM vs AMCd次之 (包含235种差异代谢物)。基于Bray Curtis和ANOSIM差异分析可知，AMF是造成代谢物质差异的主要因素 (Bray Curtis排名最大，图S7B)，其可能是通过上调黄酮合成、氨基酸代谢、苯丙素合成、次级代谢等核心途径影响代谢物质含量 (基于CK vs AM和Cd vs AMCd的组间比较, 图S7C)。如上文所述，AMF可以通过招募HM- Remover的菌群钝化Cd，因此利用权重代谢物-微生物共表达网络分析探究微生物类群变化的主要驱动因素，结果如图5A和5B所示，将代谢物利用层次聚类的方式进行模块分割 (module对应颜色)，并与微生物keystone与整体微生物群落表达量进行模型适配 (模型参数：Correlation > 0.2, p < 0.05)。结果发现 (图5C)，不同处理下微生物的keystone和微生物群落矩阵（Bray Curtis距离）均与黄酮类代谢物紧密相关 (权重与模块连接度最高), 因此认为黄酮类代谢物是影响群落变化与keystone的关键枢纽，而AMF正是通过提高黄酮分泌量 (图5C) 改变细菌群落结构。此外，利用权重代谢物-微生物共表达网络分析、Spearman相关性模型与Mantel test，分别鉴定出与具有能影响菌群与土壤性质（已筛选出具有钝化Cd能力）的代谢物与直接降低Cd迁移能力的代谢物（图5D-5F），通过比对3者发现有11种代谢物发生三元重叠，14种物质发生二元重叠，说明代谢物、微生物、土壤性质三者不仅具有直接钝化Cd的能力，三者间还存在着复杂的交互作用。

图5. 根代谢组和根际微生物组的相互作用

(A)基于bray - Curtis距离的非度量多维尺度排序和基于ANOSIM的Bonferroni排序。(B)根系代谢物的模块划分、具有模块标识的分层聚类树、分配的模块以及模块中包含的代谢物信息。从红色到绿色表示代谢物模块与微生物信息的相关性从强到中等，其中只有红色表示显著的影响 (p < 0.05)。(C)通过预测得到4种处理下细菌keystone的Spearman相关模型和代表群落特征结构的Bray-Curtis距离信息以及高效代谢物的权重排序。利用WGCNA性状函数将每个模块的特征代谢物与每个分类单元的相对丰度相关联，从而计算出Spearman相关性。(D) Spearman相关模型(r > 0.6, p < 0.05)，接种AM后两者均升高(AM vs. non-AM, t检验，p < 0.05)，并给出代谢物重量排序。(E) Spearman相关模型(r > 0.6, p < 0.05)，接种AM后Cd特性与代谢物之间存在显著差异(AM vs. non-AM, t检验，p < 0.05)，并给出代谢物重量排序。(F) Mantel试验(r > 0.6, p < 0.05)，接种AM后土壤性状与代谢物之间的差异有所增加(AM vs. non-AM, t检验，p < 0.05)，并给出代谢物重量排序。(G)基于代谢与土壤、代谢与Cd、代谢与细菌三组中相同代谢物出现频率统计的维恩图。

AMF通过对代谢-微生物-土壤的调节使根际镉钝化

为明晰根系分泌物、土壤理化因子、微生物类群和Cd之间的复杂相互作用，采用Composite结构方程模型（SEM）拟合上述关系 (图6A)，结果发现接种AMF后，根系分泌物中黄酮类物质是关键的信号，采取3种方式降低Cd的迁移能力，包括“代谢物-微生物-土壤-Cd”、“代谢物-土壤-Cd”的间接作用和“代谢物-Cd”的直接作用模式。方差分解分析（VPA）对结构方程的分析进行了很好的补充(图6B)，三者共同的叠加作用拥有降低Cd迁移的最大解释率 (42.4%)，充分体现了三者之间复杂交互作用对缓解镉毒的重要性。而就单项解释率而言微生物对Cd迁移的解释率最大 (15.5%)，而包含微生物作用的解释率（包含微生物单项及其叠加效应）总和达到72%，这也验证了三者之中，根际微生物群落的重塑是具有重要作用的结论。此外根际土壤受到根代谢物及土壤微生物分泌物等的双重影响，使得土壤胞外酶 (LaC、LiP、CAT等)、有机质(TOC、EOC、GRSP)、氧化还原电位（Eh）等成为关键的镉钝化因素。

图5. AMF-苜蓿共生体对镉的钝化过程

(A)代谢物、微生物、土壤和Cd多维数据集相互作用的结构方程模型。(B)代谢物、微生物和土壤对Cd迁移影响的方差分解分析。*表示显著差异(p < 0.05)。**表示显著差异(p < 0.01)。***表示显著差异(p < 0.001)。

方  法

紫花苜蓿盆栽实验

取农田 0-20cm 玉米田耕层土 (土壤 Cd 背景值为 0.017mg/kg)，过 2mm 筛后，与灭菌花卉土和灭菌蛭石以 3:3:1 混匀形成复合介质。再添加50g/kg灭活与未灭活AMF菌剂 (Glomus mosseae L.)，形成2种处理方式：CK (对照) 与AMF接种。将其分别装入自制的根箱，在每个根箱内栽入一颗紫花苜蓿幼苗 (中国农业科学院提供)。根箱为 PP 板材质，规格为 20cm×20cm×0.3cm，根箱背部为可开闭式门，底部用 600 目尼龙网制成，根箱中的土壤从底部向上吸水，避免从根箱顶部浇水改变土壤 Cd 的相对位置。根箱需要倾 45-50°，以确保根由于向地生长贴合根箱背部开门处，见图S1A-1C。幼苗生长期间，每10天做根部侵染率鉴定，当根部侵染率达到90%时 (图S1D，1F)，被认为是成功侵染。然后将以上两组处理分别添加 2mg/kg CdCl2 (此浓度为前期研究获得的临界浓度)和无菌蒸馏水，共形成 4 组处理，分别为 CK，Cd，AM，AM+Cd，继续培养25天。

根际Cd荧光印迹

根箱原位印记实验流程如图S1E所示，每隔5天随机选取Cd与AM+Cd处理下的植物根箱用于Cd²⁺荧光印迹实验。采用标准600目尼龙膜，剪裁成合适大小，浸泡在Leadmium荧光染料中约1h。然后打开根箱，将浸泡好的饱和吸水膜紧密贴合于表面，盖上盖子，放回原处。约0.5h后，打开根箱，取出印迹好的尼龙膜，用镊子小心除去表面的沙土与泥粒，放到紫外成像仪上，选用SyberGreen绿测荧光成像模式进行荧光成像，并拍照。使用Image J (The MathWorks)对数字图像进行分析。将RGB图像转换为黑白，并为每个像素分配一个灰度值，黑色对应的灰度值为0，白色对应的灰度值为256。计算每个圆形校准膜的平均灰度值。校准膜中的Cd浓度与它们的灰度值呈函数关系。这个函数应用于荧光谱的数字图像。为了说明结果，我们用彩色描述灰度图像的值，其中红色对应最高灰度值(256)，蓝色对应最低灰度值(0)。颜色图高于像素点灰度值的平均值的25%的区域设为红色，表示Cd聚集热点。

土壤化学性质的测量

使用pH计测量土壤pH值，土壤-水比为1:5 (PHS‐3C)。采用元素分析仪 (PHS‐3C, LEICI, China)测定土壤中有机质含量，用干燃烧碳氮分析仪(LECO)测定了总碳和总氮(N)含量。使用Lachat 8000流动注射分析仪(Vario EL-III, Elementar, Germany)分析土壤硝酸盐(NO3⁻)和氨(NH₄⁺)。采用铂电极-参比电极法测定土壤氧化还原电位。采用Bradford法测定GRSP含量。酸性磷酸酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、过氧化氢酶、脱氢酶、转化酶、漆酶、脲酶、多酚氧化酶、亮氨酸氨基肽酶、木质素过氧化物酶、FDA水解酶等采用微孔板法测定。用Excel (v.2019) 记录土壤化学性质，用SPSS (v.19)的方差分析检验显著性。

根际土壤细菌基因组DNA的提取和PCR扩增

采用CTAB法对样品的基因组DNA进行提取，之后使用琼脂糖凝胶电泳检测提取出的DNA纯度和浓度；随后取适量DNA于离心管中，并用无菌水稀释至1ng/μl。以稀释后的基因组DNA为模板，根据扩增区域选择使用带barcode的特异性引物、High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer (New England Biolabs公司的Phusion®)和高效高保真酶进行PCR，以确保扩增效率和准确性。引物对应区域：16S V4区引物（799F和1193R）：鉴定细菌多样性。PCR产物用2%浓度的琼脂糖凝胶电泳进行检测，并根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2%浓度的琼脂糖凝胶电泳再次进行检测。使用NEBNext® Ultra™ IIDNA Library Prep Kit建库试剂盒进行文库构建，将构建好的文库进行Qubit和Q-PCR定量；待文库合格后，使用NovaSeq6000进行上机测序。根据barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，截去barcode和引物序列后使用FLASH（V1.2.11, http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/）软件对样本的reads进行拼接，得到Raw Tags。随后使用fastp软件对得到的Raw Tags进行质控，得到高质量的Clean Tags。最后使用Usearch软件将Clean Tags与数据库进行比对以检测嵌合体并进行去除，从而得到最终的有效数据即Effective Tags。对以上得到的Effective Tags，使用QIIME2软件中的DADA2模块或deblur进行降噪（默认使用DADA2），并过滤掉丰度小于5的序列，从而获得最终的ASVs（Amplicon Sequence Variants，即扩增子序列变异）以及特征表。随后，使用QIIME2软件中的classify-sklearn模块将得到的ASVs与数据库比对从而得到每个ASV的物种信息。使用Silva138.1数据库注释。

微生物信息学分析

使用QIIME2软件计算Observed_OTUs、Shannon、Simpson、Chao1指数，并绘制稀释曲线(Rarefaction Curve)。使用QIIME2软件计算Unifrac距离，并使用R软件来绘制PCA、PCoA和NMDS降维图。其中，PCA和PCoA会调用R软件中的ade4和ggplot2包。随后，调用QIIME2软件中的anosim函数分析组间群落结构差异显著性。最后，使用LEfSe或R软件完成组间显著差异性物种分析。其中，LEfSe分析通过LEfSe软件来完成，默认设置LDA score阈值为3.5。MetaStat分析则使用R软件对两个比较组在门、纲、目、科、属和种6个分类水平上进行差异性检验并获得p值，筛选出p值小于0.05的物种即为组间显著差异性物种；而T检验同样使用R软件来实现各个分类水平上的物种显著差异性分析。使用PICRUSt2 (Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved Stats 2)对微生物ASV tree和ASV的基因信息推断基因功能谱，同时对Greengene数据库中其它未知物种的基因功能谱进行推断，构建细菌域全谱系的基因功能预测谱，最后将测序得到的菌群组成“映射”到数据库中，从而进行菌群代谢功能预测。细菌网络拓扑参数在Cytoscape v 3.8.0和Gpehi v 0.9.2中计算。

微生物-环境因子关联分析

在进行Spearman相关性分析时，首先用R中Psych包的Corr.test函数计算物种和环境因子的Spearman相关系数值并检验其显著性，然后用Pheatmap包中的 Pheatmap函数进行可视化。Mantel test使用的是R中的vegan包，根据物种矩阵和提供的环境因子数据矩阵，首先使用Vegdist函数对两类数据进行距离矩阵的转化，然后用Mantel函数对两类矩阵进行Spearman相关性分析得到r和p值。

根代谢物质测定

用2 × 1 ml含1%甲酸的70%甲醇和1 × 1 ml含1%甲酸的乙醇制备5 - 50 mg冻干和研磨的根提取物。加入萃取溶剂后，反应管旋涡30 s，在含冷水的超声浴中超声15 min，在4℃的高架振动筛中振荡2 h。离心 (15,000转/分，30分钟，4°C)后，转移上清液并汇集在5ml反应管中。提取液在45°C的高速真空中干燥。干燥后的样品用50 μl含0.1%甲酸的50% MeOH重悬。将40 μl的体积转移到超高压液相色谱(UPLC)瓶中，测量值归一化为总根干质量。所有样品的剩余体积汇集，涡流并转移到UPLC小瓶中作为质量控制样品。色谱分离采用VanquishT UHPLC系统 (Thermo Fisher Scientific)。黄酮 (芹菜素、木犀草素，纯度≥99%;在Acquity UPLC HSS T3反相色谱柱 (100 Å， 2.1 mm × 150 mm, 1.8 μm;使用梯度洗脱a (水，0.1%甲酸)和B(乙腈，0.1%甲酸)，方法如下:0-1分钟，10% B;1-2分钟，10-30% B;2-5分钟，30-65% B;5 - 6分钟，65-85% B。额外的步骤包括柱冲洗和平衡，产生13分钟的总运行时间。为了保持分离的完整性，一个保护柱(130 Å， 2.1 mm × 5 mm, 1.8 μm;沃特斯(Waters)也被使用。柱温设置为35℃，流速为0.3 ml min-1。注射量为5 μl。UHPLC系统与配备加热电喷雾电离源的Q-Exactive Plus质谱仪耦合，在正离子模式下工作。源值设置如下:喷雾电压，3.5 kV;毛细管温度:320℃;s镜头射频电平，50;辅助燃气加热器温度，400℃;护套气体流速，50;辅助气体流量，14。为了获取光谱，进行了靶向单离子监测/数据依赖质谱/质谱(MS2)实验。全扫描的分辨率设置为70000。串联质谱(MS)实验的分辨率为17500，归一化碰撞能量为40 V。质谱数据由Trace Finder软件(v.4.1, Thermo Scientific)获取和处理。从1,000 ppb的原液中制备10个校准溶液，范围为1-800 ppb，含有芹菜素和木犀草素标准品，50%的甲醇和0.1%的甲酸。通过测量质子化分子离子[M+H]+提取的离子色谱上的峰面积来生成校准曲线。采用浓度倒数的最小二乘线性回归加权法拟合曲线的线性度。定量限为1 ppb。通过对萃取物的保留时间、高分辨率m/z谱和同位素模式与标准品的比较，对萃取物中的化合物进行了鉴定。此外，生成的串联质谱在定制的谱库中进行检索，以确认鉴定的化合物。

宿主根代谢组的功能变化如何与微生物类群的环境变化相关联

使用R包基于WGCNA，将代谢物离子扫描谱系中数据源代替基因表达量，以识别定量数据集之间的相关性: (1) 4种处理下紫花苜蓿根部之间的代谢物共表达模块; (2)模块特征代谢物定量值-微生物类群关联和模内枢纽代谢物。WGCNA是一种无监督的分析方法，可以根据180种物质特异性样本的表达谱对基因进行聚类。为了稳健地构建共表达网络，我们仅保留至少一种物质的对应区域的mapped reads≥5的色谱峰面积，以及由CLC Genomics Workbench生成的区域之间的差异表达基因。物质表达按log2 (FPKM + 1) 表达进行归一化。软阈值功率β计算邻接。为了最小化噪声和错误关联的影响，我们将邻接转换为拓扑重叠矩阵(TOM)，并将相应的不相似点(dissTOM)计算为1 - TOM。对于层次聚类，我们使用dissTOM作为距离度量，并将最小模块大小(基因数量)设置为30来检测模块。为了量化整个模块的共表达相似性，根据它们的相关性计算它们的特征基因并聚类，随后用于研究代谢物表达差异与微生物性状之间的串扰。我们选择与集群模块的相关值为0.9。模块特征代谢物用于表示模块内的物质表达模式。将带有分类信息的精细化细菌OTU表的相对丰度进一步导入WGCNA数据框架，并将每个分类分类单元视为一个“特征区间”。模块特征代谢物与这些微生物性状的相关性最为显著。然后生成皮尔逊相关及其相关的P值所有模块特征基因表达值的成对比较。Bonferroni调整校正多重比较。我们进一步研究了那些与微生物类群高度相关的模块，以确定与微生物类群相关的高度连接模块“枢纽”代谢物种类。模块/特征代谢物与微生物类群的高度相关性由Cytoscape (v.3.7.0)显示，如上所述。

代谢物、微生物、土壤因子与Cd聚集热点百分比的关系

使用Spearman与Mantel test分别确定代谢物-Cd聚集热点百分比和代谢物-土壤因子的对应关系，为了提高准确率将阈值设为r > 0.6, p < 0.01。得到结果后利用随机森林模型对结果进行比对，保留重复项。随机森林算法采用Boruta算法进行计算，为了提高准确率将变量重要性阈值设为 > ShadowMax。Mantel test 采用dplyr与linkET程辑包，同样将阈值设为r > 0.6, p < 0.01。使用以上算法排除不同数据集中非显著因子后，整体进行Composite结构方程模型拟合4项数据集变量的关系，其采用nlme、lme4、piecewiseSEM和QuantPsyc程辑包进行。为了确定代谢物、微生物、土壤因子对Cd聚集热点百分比的相对贡献率，采用VPA（variance partial analysis），使用vegan包量化单项数据因子及其他们的交互作用对Cd聚集热点百分比的解释量。

讨  论

代根际细菌重建“功能群落”的招募

利用ANOSIM分析发现，AM和Cd诱导根际微生物群落重建 (图2D)。AMCd处理组由49属细菌组成HM (Heavy Metal)- Remover (图3E)。这是微生物Cd钝化的原因之一。那么，这些耐药微生物群落是如何形成的呢? 我们首先分析了AM实验组 (没有Cd暴露)是否也可以招募功能微生物。AMF共招募了32种常见的根际生长促进菌 (AM与非AM)，其中19种具有固氮能力，10种具有溶磷能力，3种具有两种能力 (图S8)。这就解释了为什么接种AM可以有效缓解根际土壤中镉污染造成的氮磷限制 (图S4-S6)。Spearman相关模型(r > 0.6, p < 0.01)，随机森林模型预测 (Importance > ShadowMax)和HM-remover (图3F)，其中植物促生根瘤菌(PGPR) 10株(表S3)。根据以下研究，将其对重金属的作用机制分为三类。第一类包括对重金属的吞噬(表S4)，它有19个类群，包括Bacteroides、Burkholderia和Candidatus Solibacter，可以直接摄入(吞噬)重金属离子。第二类具有表面吸附能力(表S4)，包括Asticcacaulis、Bacillus、Bacteroides等15个类群。上述细菌的生物膜表面存在丰富的-OH、C=O、-NH等官能团，可与Pb、Cu、Hg、Cd等二价重金属离子直接络合，这可以很好地解释有机结合的Cd增加 (图1E)。第三种细菌通过分泌来降解Cd，包括酸化杆菌、aliicyclobacillus和alloorhizobium等10种细菌 (表S4)。Acidobacterium、Acidocyclobacter和 Bordetella的分泌物将金属离子还原为矿物结合态和残留态。Parvibaculum、Phenylobacterium和Porphyrobacter分别产生细胞外聚合物，金属硫蛋白和卟啉，它们都是强金属配合物。这些微生物通过改变土壤性质(胞外酶、GRSP、MBC和Eh)间接减少镉的迁移。因此，招募的“功能群落”在几个方面减少了Cd迁移。

AMF招募耐药微生物群落的非偶然行为

AMF可以招募PGPR，然而HM-Remover招募的随机性需要验证。因此，我们将有关AMF与根际细菌关系的文献整合到34个平行实验中进行Meta分析(方法和结果详见补充资料，参考文献见表S5)。上述文献中Cd耐药菌的筛选与本研究中去除hm菌株的筛选基本吻合 (表S6)。其中，Rhodoplanes、Burkholderia、Sphingomonas等33个分类群频繁出现 (排名前25%) (图S9)。我们发现本地微生物物种(OTUs) 是造成频率差异的主要原因 (p < 0.05) (图S10)，随机森林模型结果也与上述结果一致 (图S11)。具体而言，两者之间存在显著的正相关关系 (r = 0.53, p = 0.0011) (线性拟合模型，图S12)，并且与草地、园林、农田、沼泽和荒地生态系统的调节一致 (p < 0.05) (图S13)。这有效地证明了AMF可以招募重金属抗性细菌，但招募的数量和类型取决于本地微生物(OTUs)的种类，这解释了重合率的差异 (p < 0.05) (图S10)。

耐金属细菌的生存环境起着关键作用

虽然上述分析证明了AMF招募的抗性菌是普遍存在的，但这并不意味着耐重金属功能微生物主导群落功能。相反，一些研究表明，AMF可以促进参与硝化和反硝化过程、固氮和结瘤的细菌成为Keystone。这是因为大多数试验都是在土壤缺氮缺磷的情况下接种AMF，最终导致根际微生物群的核心功能倾向于养分获取策略。因此，我们认为只有当环境胁迫导致招募的功能微生物成为Keystone时，它们才发挥重要作用。AMF随机招募细菌后，大多数细菌具有功能冗余，在遇到胁迫时，功能性微生物救济起主导作用。同时，如果逆境压力过大，则在招募过程中会伴随着细菌的死亡，只保留生命力强的耐药微生物。与我们的研究类似，AMF和Cd可以招募它们偏好的Keystone菌种 (图3D)。在AMCd处理中，与AM处理组相比，接种AM后的关键细菌如Parvibaculum、Alistipes、Lactobacillus、Duganella、Ramlibacter、Bacteroides和LWQ8增加 (表S1)。这7种细菌属于HM-Remover (表S2)，这可能是AMCd中HM-Remover特征组的原因之一。同时，通过ggClusterNet，明确区分了Cd迁移和化学态变化相关模块，上述Keystone也是模块的重要枢纽 (图S14)。综上所述，AMF对微生物的广泛招募与Cd对微生物的筛选作用相结合，构成了AMCd处理中重金属抗性的功能模块。

根代谢产物影响根际细菌群落的聚集

植物可通过根系分泌物释放20-40%的光同化碳，其组成和含量与植物代谢产生的大分子代谢物和被动扩散的低分子量化合物有关。植物根系的特定代谢物(香豆素、黄酮和苯)作为分泌物影响根际微生物群和特定物种的富集。在本研究中，使用加权代谢物-微生物共表达网络分析进行预测，糖、黄酮、香豆素、酚、脂肪酸和氨基酸与微生物群落组成 (Bray Curtis距离)和关键蛋白显著相关 (图S7A-C)。在随机森林模型中，黄酮类化合物对优势菌种和关键菌的影响最大。此外，补充实验证实，它可以大量分泌到外部环境中 (图S15)。因此，黄酮类化合物是影响细菌群落重组的信号调节因子。特别是植物性黄酮类化合物调节根际微生物群落。植物与微生物之间的相互作用分两个阶段进行。首先，植物向根际分泌能够促进、限制或抑制微生物活动和增殖的化学信号。黄酮类化合物通常被认为是信号分子，可以选择性地促进PGPR (如Azotobacter) 的生长和繁殖。AMCd处理的Keystone和优势种（top10）主要是PGPR (包括HM-remover)，可能是由于黄酮类化合物的高贡献度(图5C)。第二阶段是群体感应 (quorum sensing, QS) 过程，微生物检测到植物根系释放的低分子量化合物，并通过信号级联调节各种微生物群体的活动。植物性黄酮类化合物可能是AHL家族信号通路的调控分子(AHL介导的QS系统是第一个“语言家族”)。此外，系统发育性脂类、酚类、醇类、酮类、醛类、键酮类和萜烯类被用作QS信号物质，全面调控微生物群落，这与我们对代谢物种类的预测一致 (图5C-F)，即多肽、香豆素、脂肪酸、苯、酚、次生代谢物和其他物质对微生物组的组装有重要贡献 (p < 0.01),且上述物质可以有效地分泌到外部环境中 (图S15)。综上所述，AMF通过类黄酮代谢物作为优势代谢物与其他小分子的叠加作用调控根际微生物重建。虽然该模型用于预测代谢物与微生物之间的关系(高阈值背景)，但要验证两者之间的关系，需要准确的单个/组合添加代谢物实验进一步验证。