2024合成生物学竞赛常规赛队伍专题之SUSTech-Med团队丨基于CBASS系统的铜绿假单胞菌生物被膜的杀伤策略

随着现代科学技术尤其是医疗技术的进步，在疾病治愈率大幅提升的同时，另一种不可忽视的风险因素出现在人们的视野中——耐药菌。在疾病治疗的过程中，由于抗生素等药物的广泛使用，细菌们为了生存，也发展出了自己的免疫系统，就像人类抵御外部入侵的细菌、病毒一样。通过这类途径，细菌可以或将药物“吐”出体外或将药物作用靶点切除或进化出顽固的生物被膜抵御药物进入。本期我们着重介绍的铜绿假单胞菌，就属于最后一类[1]。

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种革兰氏阴性细菌，属于假单胞菌属。这种细菌在自然环境中广泛分布，但在一些情况下可能对我们的健康造成潜在威胁，属于机会致病菌1。铜绿假单胞菌通常参与形成称为生物被膜的结构。生物被膜是由微生物（包括细菌、真菌、藻类等）在液体或固体表面形成的一层黏附的生物薄膜。这种薄膜不仅由微生物本身构成，还包含一些分泌的黏附物质，进而形成了一个复杂的微生物社群（图1）。

生物被膜是一种主要由自生细胞外聚合物构建的结构，其作用是作为支架将细菌包裹在表面，并保护它们免受环境压力的影响，阻碍吞噬作用，从而赋予定植和长期存在的能力。生物被膜能够附着于各种表面，包括管道、设备和人体组织等，成为医院感染的源头和影响水质的重要原因。

图1：生物被膜的形成过程[2]

而抗生素作为人们针对细菌的“利器”，是治疗细菌感染的强效药物。但这些药物的不当使用导致了抗生素耐药性在大多数细菌中的传播。铜绿假单胞菌作为一种机会性病原体，经常对几种抗生素产生耐药性，属于世界卫生组织研究和开发新抗生素的优先病原体名单中的“关键”类别。除了对几种抗生素具有显著的内在耐药性外，铜绿假单胞菌还可以通过染色体突变和抗生素抗性基因的获取而获得耐药性。铜绿假单胞菌拥有最大的细菌基因组之一，并可通过水平基因转移获得大量异源的基因，这些基因经常定位在整合子和可移动遗传元件中，如转座子、插入序列、基因组岛、噬菌体、质粒以及整合和偶联元件。而基因组的多样性也为铜绿假单胞菌提供了高度耐药性[3]。

正所谓“卤水点豆腐——一物降一物”，耐药菌既然是生物，那么就一定存在天敌与之制衡。但并不同于其它动植物天敌之间的捕食关系，细菌的天敌与它们之间更多是寄生的关系。没错，这就是本期的主人公——噬菌体。

噬菌体是感染细菌、真菌、藻类、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。这些抗菌利器于二十世纪初在葡萄球菌和志贺菌中首先被发现。作为病毒的一种，噬菌体同样具有病毒的一些共性：个体微小、不具有完整细胞结构、只含有单一核酸。作为一种“捕食”细菌的生物，噬菌体基因组含有许多个基因，但所有已知的噬菌体都是利用细菌物质和能量来实现其自身的生长和增殖。一旦离开了宿主细胞，噬菌体既不能生长，也不能复制。可以说，噬菌体和细菌在进化上是一对死对头，两者相辅相成，这便生物学上常说的共同进化。

噬菌体可分为烈性噬菌体和温和噬菌体两种类型。

烈性噬菌体，亦称毒性噬菌体，指在宿主菌体内复制增殖、产生许多子代噬菌体，并最终裂解细菌的一类噬菌体。其增殖方式是复制，增殖过程经历吸附穿入、生物合成和成熟释放三个阶段。进入菌细胞内的噬菌体核酸首先经早期转录产生早期蛋白质，并复制子代核酸，再进行晚期转录产生噬菌体的结构蛋白。子代噬菌体达到一定数量时，由于噬菌体合成酶类的溶解，菌细胞突然裂解，释放出的噬菌体再感染其他敏感细菌，周而复始。

而温和噬菌体则像潜伏在敌人内部的“特工”，其感染宿主菌后缺并不增殖。其基因整合于细菌染色体上，即前噬菌体，随细菌染色体的复制而复制，并随细菌分裂而分配至子代细菌的染色体中。温和噬菌体有溶原性周期和溶菌性周期，可偶尔自发地或在某些理化或生物因素的影响下，整合的前噬菌体脱离宿主菌染色体，进入溶菌性周期导致细菌裂解，并产生新的成熟噬菌体。

综上所述，噬菌体可以算作是在任何水平上都能得知细菌的存在，现在临床上也在积极引入噬菌体疗法。但是，本次介绍的铜绿假单胞菌，不仅具有广泛的抗生素抗性，又能产生很好地阻滞噬菌体侵的生物被膜，我们又该如何应对呢？这就要介绍我们这期的第二位重要嘉宾——CBASS系统。

正如电影《侏罗纪公园》的一句经典台词“Life will find a way（生命总能找到出路）”说的那样，在漫长的进化旅程中，细菌也进化出了独特的防御机制。而基于环寡核苷酸的抗噬菌体信号系统（Cyclic-oligonucleotide-based anti-phage signaling system，简称CBASS）作为其中之一，是一类与动物cGAS-STING先天免疫通路同源的抗噬菌体防御系统。CBASS系统由寡核苷酸环化酶和效应器两部分组成，寡核苷酸环化酶在噬菌体感染时产生信号环寡核苷酸，效应物被环寡核苷酸激活并通过膜损伤、DNA降解或其他方式促进细胞死亡[4]。根据它们的操纵子组织、信号分子和效应功能对系统进行分组，可将CBASS系统分为四种主要的类型：I型CBASS包含一个紧凑的双基因系统，由寡核苷酸环化酶和效应基因组成，没有辅助基因，这是最丰富的CBASS系统；II 型CBASS除了双基因系统之外，还包括编码泛素相关结构域的辅助基因；III 型CBASS包括编码HORMA和TRIP13结构域的辅助基因，这些蛋白质形成信号复合物，控制真核生物减数分裂、有丝分裂和 DNA 修复的步骤，同时对于噬菌体防御至关重要，且实验表明TRIP13 是环状寡核苷酸产生的负调节因子；IV 型 CBASS是一种罕见的系统，包括具有核苷酸修饰结构域的辅助蛋白。在CBASS系统的作用下，细菌会“舍生取义”：他们会开启“自杀”过程，而该过程发生在噬菌体大量复制之前，可以防止噬菌体向附近的细菌扩散，这何尝不是一种很伟大的行为呢？

图2：CBASS系统的作用原理[4]

在了解了CBASS基因的组成和功能之后，我们开始思考一个问题：能否利用这个原本用于抵御噬菌体的防御系统来解决临床上的生物被膜问题呢？在自然环境中，携带CBASS基因的细菌就像是森林中的防火带，能够抵御噬菌体的侵袭。当生物被膜遭受噬菌体侵染时，携带CBASS基因的细菌会启动基因“自杀”，阻止噬菌体的扩散。然而，如果生物被膜中大部分细菌都携带CBASS基因，当遭遇噬菌体侵袭时，这些细菌会因为CBASS基因的激活而死亡，反而加剧了噬菌体对生物被膜的破坏作用。我们的实验旨在通过特定方法让生物被膜中的大多数细菌都携带CBASS基因，使其在遭遇噬菌体侵袭时能够自动死亡，从而有效地减少生物被膜的问题。为此，我们设计了两个平行实验。

在第一个平行实验中，我们计划培养出含有CBASS基因质粒并具有接合能力的大肠杆菌。这种大肠杆菌同时包含有两种质粒，一种是含有CBASS基因的重组质粒，另一种是接合转移辅助载体，如pRK600。在成功培养出这种大肠杆菌后，我们将会把它与铜绿假单胞菌生物被膜共同孵育，让CBASS基因以接合的形式由大肠杆菌传递给铜绿假单胞菌，再进行铜绿假单胞菌的互相接合传递，使生物被膜中的大部分菌都得到含有CBASS基因的质粒。这样的生物被膜在面对烈性噬菌体侵染时会因为CBASS基因的激活而裂解死亡，从而增强了噬菌体对铜绿假单胞菌生物被膜的杀伤效果。

在第二个平行实验中，我们受到噬菌体疗法的进一步启发，计划构建一个可以传递CBASS基因的工程温和噬菌体。温和噬菌体不会直接导致细菌死亡，而会将自己的基因整合进入宿主的基因组或者以质粒的形式存在于宿主中，随宿主的基因一起复制。通过改造温和噬菌体使其整合有CBASS基因，我们可以将其传递到铜绿假单胞菌生物被膜中，并持续产生新的温和噬菌体，使CBASS基因逐渐在菌群中传播。当使用烈性噬菌体侵袭生物被膜时，CBASS基因会被激活，从而有效地杀伤生物被膜。

在这个耐药性日趋严重的“后抗生素时代”，随着我们对细菌免疫系统以及噬菌体的多样性、进化模式和宿主互作关系的认知的不断加深，基于CBASS的系统的铜绿假单胞菌生物被膜的杀伤策略将为更多耐药菌引发的疾病带来新的曙光。