Nat Microbiol. | 流感病毒利用 mGluR2 作为内吞受体进入细胞

KCa1.1 plays an important role in influenza virus internalization.

离子通道在病毒感染过程中起着关键作用，作者首先重点研究了钾通道在流感病毒复制中的作用。在已鉴定的16个与钾通道相关的基因中，发现KCa1.1的下调对A549细胞中H1N1病毒的复制影响最大（图1a-d）。为了进一步证实这一观察结果，在A549细胞中用KCa1.1的功能性拮抗剂paxilline进行了药物抑制试验。结果显示paxilline治疗对细胞活力没有影响（图1e），但以剂量依赖性方式显著抑制了H1N1病毒的复制（图1f）。这些结果表明KCa1.1在流感病毒感染中起着重要作用。

为了研究流感病毒复制的哪个阶段受 KCa1.1 影响，作者在不同时间点添加paxilline并进行分析。在添加paxilline 6 小时后，通过定量 PCR (qPCR) 量化细胞裂解物中的相对病毒 RNA (vRNA) 水平。与对照细胞相比，预先1 小时或 0 小时进行paxilline处理显著降低了细胞中的 vRNA 水平，但在添加 1 小时、2 小时或 3 小时后进行的处理与对照细胞相比，vRNA 水平没有差异 (图 1g)，这表明 KCa1.1 在流感病毒感染的早期步骤中起着关键作用。 

流感病毒感染的早期步骤包括附着在细胞表面的唾液酸受体上并内化到细胞中。 为了研究 KCa1.1 是否影响不同处理细胞中的流感病毒附着，通过 qPCR 量化了附着病毒的 vRNA 水平。发现 NA 处理显著降低了病毒结合，而 KCa1.1 沉默或 paxilline 处理没有 (图 1h)，表明 KCa1.1 对流感病毒结合没有影响。 

为了研究 KCa1.1 是否参与了内化步骤，通过 qPCR 量化了不同处理细胞中内化病毒的 vRNA 水平。paxilline 处理的细胞或 KCa1.1 沉默的细胞内的 vRNA 水平明显低于对照细胞 (图 1i)，表明活化的 KCa1.1 对流感病毒内化很重要，并通过三维显微镜分析进一步得到证实，该分析定量检测了在非通透条件下内化期后保留在细胞膜上的抗体标记病毒 (图 1j、k)。然而，KCa1.1 过表达细胞内的 vRNA 水平与对照细胞相当 (图 1l)。

mGluR2 plays an important role in influenza virus internalization.

通过先前研究发现七个宿主因子（mGluR2、CPNE9、ADCY5、NTSR2、GABRA5、SCN8A 和 MPDZ）是肺泡上皮细胞中表达的细胞跨膜蛋白，可能激活 KCa1.1。为了评估它们对流感病毒复制的影响，作者为这七个候选基因中的每一个设计了两个特定的 siRNA 用于 RNAi 检测，发现四个基因（mGluR2、CPNE9、ADCY5 和 NTSR2）的敲低导致 A549 细胞中的病毒滴度降低，而其他三个基因的敲低对流感病毒复制没有影响（图 2a）。作者接着评估了这四个基因对流感病毒结合和内化的影响，结果显示这些宿主因子均不影响流感病毒结合，只有 mGluR2 影响流感病毒内化（图 2b），这通过基于显微镜的检测得到进一步证实（图 2c）。 

为了研究 KCa1.1 和 mGluR2 是通过相互依赖的过程还是独立起作用，作者比较了paxilline处理的 A549 细胞、mGluR2 沉默的 A549 细胞和paxilline处理的 mGluR2 沉默的 A549 细胞中的 H1N1 病毒复制。结果显示同时阻断 KCa1.1 和 mGluR2 对病毒滴度降低没有附加作用（图 2d），排除了独立运作的可能性。为了探究KCa1.1和mGluR2是否协同促进流感病毒的内化，通过在质粒转染的HEK293细胞中进行共免疫沉淀实验来验证两者的相互作用（图2e），同时比较了内源表达KCa1.1和mGluR2的A549细胞中，单独转染mGluR2表达质粒或与KCa1.1表达质粒共转染后附着和内化的H1N1病毒的vRNA水平。作者发现单独过表达mGluR2不会增加附着和内化的病毒的vRNA水平，而同时过表达KCa1.1和mGluR2不会增加附着病毒的vRNA水平，但会显著增加内化的病毒的vRNA水平（图2f）。这些结果表明KCa1.1和mGluR2共同促进流感病毒的内化。

为了研究 KCa1.1 和 mGluR2 是否随流感病毒内化，采用显微镜分析方法量化了 H1N1 病毒内化前后细胞膜上 KCa1.1 和 mGluR2 的丰度。H1N1 病毒内化的细胞膜上 KCa1.1 的荧光强度与未感染的对照 A549 细胞或 H1N1 病毒结合细胞的荧光强度相当（图 2g），但 H1N1 病毒内化的细胞膜上 mGluR2 的荧光强度明显低于未感染的对照 A549 细胞或 H1N1 病毒结合细胞的荧光强度（图 2h），这表明 mGluR2 会随流感病毒内化，而 KCa1.1 不会。值得注意的是，在 KCa1.1 沉默的细胞中，H1N1 病毒内化细胞膜上的 mGluR2 荧光强度与对照 A549 细胞和病毒结合细胞相当（图 2i），这表明 KCa1.1 是 mGluR2 内化所必需的。

Influenza virus uses mGluR2 as an endocytic receptor for its CME.

除了 CME，流感病毒还利用 Caveolin 介导的内吞作用和巨胞饮作用进入细胞。网格蛋白重链 (CLTC)、Caveolin 1 (CAV1) 和 Rac 家族小 GTPase 1 (RAC1) 分别是参与 CME、Caveolin 介导的内吞作用和巨胞饮作用的关键分子。为了研究流感病毒内化的哪条途径涉及 mGluR2，作者首先评估了 CLTC、CAV1 和 RAC1 沉默的 A549 细胞膜上 mGluR2 的丰度。H1N1病毒内化后，mGluR2在A549细胞中的变化与对照细胞相同。CLTC沉默细胞膜上mGluR2的荧光强度明显高于对照细胞，而CAV1或RAC1沉默细胞膜上mGluR2的荧光强度与对照细胞相当（图3a），表明mGluR2参与了流感病毒的CME。 由于 mGluR2 不影响流感病毒结合，但对于流感病毒内化必不可少，作者推测 mGluR2 可能充当内吞受体，并将病毒结合信号传递到质膜上以启动 CME。为了验证这一假设，作者首先测试了 HA 和 mGluR2 的相互作用，发现 HA-His 被 mGluR2 成功拉下（图 3b），使用STED 超分辨率显微镜进一步证实了这一点，结果表明 在病毒内化过程中mGluR2 和 H1N1 病毒粒子共定位（图3c）。此外，利用免疫电子显微镜，在流感病毒内吞的不同阶段的细胞膜上检测到了mGluR2，包括含有流感病毒的内陷小窝的细胞膜和成熟的内吞囊泡的细胞膜，这与网格蛋白包被小窝（CCP）和网格蛋白包被载体（CCV）的细胞膜一致（图3d）。

为了研究 mGluR2 与 HA 之间的相互作用是否对流感病毒内化很重要，作者使用带有谷胱甘肽 S-转移酶 (GST) 标签的纯化的 mGluR2 胞外结构域 (mGluR2-GST) 进行了感染性中和试验。mGluR2-GST 在最高浓度下不影响细胞活力 (图 3e)；它在 A549 细胞中以剂量依赖性方式抑制 H1N1 病毒感染 (图 3f)。作者进一步使用针对 mGluR2 胞外结构域的单克隆抗体 (mGluR2-ma) 进行了抗体阻断试验，发现 mGluR2-ma 以剂量依赖性方式抑制 H1N1 病毒感染 (图 3g、h)。mGluR2 不影响腺病毒 5 型或转铁蛋白的内吞作用（图 3f、h、i），尽管它们也通过 CME 进入细胞，这表明 mGluR2 介导的 CME 具有货物特异性。这些结果表明 mGluR2 直接与 HA 蛋白相互作用并充当流感病毒 CME 的内吞受体。

KCa1.1 facilitates influenza virus internalization by regulating F-actin polymerization

KCa1.1 既不与流感病毒的 HA 相互作用，也不与病毒内化，这表明 KCa1.1 可能调节与流感病毒 CME 相关的其他因素。KCa1.1 通道可能由 Ca²⁺、膜电位或膜拉伸激活。平滑肌 KCa1.1 通道的拉伸敏感性涉及与 F- 肌动蛋白的相互作用，而 F- 肌动蛋白动力学对于有效完成 CCPs至关重要。因此，作者推测流感病毒结合引起的 Ca²⁺ 或膜拉伸变化可能会激活 KCa1.1，从而调节 F- 肌动蛋白聚合。为了验证这一概念，作者评估了 A549 对照细胞中的 F- 肌动蛋白聚合；用 paxilline 或细胞松弛素 D (cyto D)（一种肌动蛋白聚合抑制剂）处理的 A549 细胞；以及 H1N1 病毒内化后 KCa1.1 敲低的 A549 细胞。F-actin 染料 phalloidin-488 染色显示，与 A549 对照细胞相比，KCa1.1 敲低细胞、paxilline 处理的细胞和 cyto-D 处理的细胞中的 phalloidin 荧光强度降低（图 4a）。此外，与 KCa1.1 敲低一样，cyto D 处理也消除了 mGluR2 的内化（图 4b），从而阻止了流感病毒的内化（图 4c）。这些结果表明，KCa1.1 的激活对 F-actin 聚合有积极影响，从而促进流感病毒的 CME。 为了进一步显示 KCa1.1 和 mGluR2 在流感病毒 CME 中的作用，作者观察到在结合后 1 分钟或 6 分钟时流感病毒 CCP 形成。使用透射电子显微镜观察了 A549 细胞、KCa1.1 敲低 A549 细胞、mGluR2 敲低 A549 细胞和用氯丙嗪（ CME 抑制剂）处理的 A549 细胞中的病毒颗粒，发现在 1 分钟后，附着在对照细胞、KCa1.1 敲低细胞、mGluR2 敲低细胞和氯丙嗪处理细胞膜上的病毒颗粒分别有 51.5%、17.5%、20.2% 和 2.5% 形成了清晰的 CCP；而附着在对照细胞、KCa1.1 敲低细胞、mGluR2 敲低细胞和氯丙嗪处理细胞膜上的病毒颗粒中分别有 91.7%、33.8%、44.4% 和 8.0% 在感染后 6 分钟形成了清晰的 CCP（图 4d）。这些结果表明 KCa1.1 和 mGluR2 在流感病毒的 CME 中起着重要作用。

Studies in mGluR2-knockout mice

体外研究表明，mGluR2 在流感病毒的 CME 中起直接作用。为了研究 mGluR2 是否影响体内流感病毒感染，作者评估了不同流感病毒在野生型和 mGluR2 敲除 (mGluR2^−/− ) 小鼠中的复制和致死率。16 只野生型 C57BL/6J 小鼠和 mGluR2^−/− 小鼠组通过鼻腔内接种 10 只 50% 小鼠致死剂量的流感病毒。每组中的三只小鼠在感染后第 3 天和第 5 天被安乐死，并收集它们的器官（包括鼻甲、肺、脑、肾和脾）进行病毒滴定。每组剩余的 10 只小鼠接受体重变化和 2 周存活率监测。感染后第 3 天和第 5 天，所有野生型小鼠的鼻甲、肺和肾脏中均检测到 H1N1 病毒，感染后第 5 天，其中一只小鼠的脾脏中也检测到了病毒。然而，仅在 mGluR2^−/− 小鼠的鼻甲和肺中检测到病毒，滴度明显低于野生型小鼠（图 5a）。野生型小鼠体重减轻近 29%，感染后第 9 天全部死亡。mGluR2^−/− 小鼠体重减轻情况类似，但其中 60% 存活下来（图 5b、c）。在野生型小鼠的所有五个测试器官和mGluR2^−/−小鼠的四个测试器官（不包括大脑）中均检测到了H5N6病毒，并且mGluR2^−/−小鼠器官中的滴度明显低于野生型小鼠（图5d）。野生型小鼠体重减轻近23％，并且在感染后12天内全部死亡（图5e，f）。然而，mGluR2^−/−小鼠体重减轻约12％，存活率为70％（图5e，f）。在野生型小鼠的五个测试器官中的四个（不包括脾脏）中检测到了H7N9病毒，在mGluR2^−/−小鼠的鼻甲和肺中仅检测到了H7N9病毒。mGluR2^−/−小鼠器官中的滴度明显低于野生型小鼠（图5g）。野生型小鼠体重减轻近19%，感染后11天内全部死亡，而mGluR2^−/−小鼠体重减轻约8%，存活率达70%（图5h、i）。这些研究表明，mGluR2敲除显著减弱了流感病毒在小鼠鼻甲和肺脏中的复制，并阻止了H5和H7病毒在小鼠脑中的复制。免疫组织学研究和双染色分析表明，mGluR2^−/−小鼠肺脏中病毒抗原阳性细胞（MUC1⁺ II 型肺泡上皮细胞、AQP5⁺ I 型上皮细胞和 S100A9⁺ 巨噬细胞）明显少于野生型小鼠（图6），表明mGluR2敲除降低了流感病毒的整体复制水平，但不影响病毒细胞向性。

Model of the roles of mGluR2 and KCa1.1 in the CME of influenza virus. 

作者鉴定出两种对流感病毒 CME 至关重要的蛋白质，KCa1.1 和 mGluR2。mGluR2 与 HA 相互作用并作为流感病毒CME的内吞受体发挥作用，KCa1.1通过调节F-肌动蛋白的聚合来促进这一过程，F-肌动蛋白的聚合是流感病毒CCP成熟和流感病毒CME完成所必需的。

学习心得

该研究发现代谢型谷氨酸受体亚型 2 (mGluR2) 和钾钙激活通道亚家族 M alpha 1 (KCa1.1) 参与了流感病毒 CME 的启动和完成；首次证明了流感病毒感染细胞的吸附和内化过程由不同受体介导；并提出阻断 HA 和 mGluR2 相互作用可能是一种有前途的宿主导向抗病毒策略。

通过对本篇论文的研读，除了学习到了其环环相扣和逻辑性的思路之外，更多地启发了一些关于抗禽流感病毒疫苗研发的想法。目前已知的中和抗体作用机制，主要包括阻断病毒-细胞相互作用和介导免疫调理作用。在《Science》上发表的一篇论文——“A non-competing pair of human neutralizing antibodies block COVID-19 virus binding to its receptor ACE2” 发现从一名新冠康复患者中分离出的两种单克隆抗体B38和H4抗体，可以阻止病毒S蛋白受体结合区域RBD与人体细胞受体ACE2之间的结合。在抗禽流感病毒疫苗的研发中，可以引入阻断HA与宿主细胞某蛋白结合的相关表位或多种表位串联来达到抗病毒效果。

本文作者：孙续文

责任编辑：孙亚妮，赵钦

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38849624/

文章引用：doi: 10.1038/s41564-024-01713-x