基于mRNA的药物或疫苗的多项临床试验未能顺利通过I期或II期，其背后的原因是多种多样的，包括候选药物疗效低下，临床风险/治疗收益状况低于预期等。临床前安全性评估旨在确定耐受性良好且有效的LNP-mRNA制剂，当观察到毒性时，体内、体外和离体实验旨在了解潜在的机制，并在理想情况下改进开发中配方的设计。
LNP-mRNA制剂在临床前开发中的主要安全性问题可分为免疫致病性和肝脾毒性（仅考虑对修饰和/或dsRNA纯化后的mRNA的研究），了解LNP-mRNA制剂不同配方的不良反应机制有助于我们更好地设计、优化耐受性良好且有效的候选药物。
由于LNP-mRNA具有明显的肝脏和脾脏生物分布，肝脏和脾脏的显微镜观察和组织病理学是临床前开发期间的标准做法。常规通过测量血浆中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和碱性磷酸酶（APT）水平来评估急性药物性肝损伤。目前大多数LNP-mRNA治疗应用的公开研究只报告了轻微的病理发现。
在一项此类研究中，合成了编码人甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶（hMUT）的修饰 mRNA，以治疗甲基丙二酸血症/酸尿症（MMA，一种极其罕见的代谢紊乱疾病）的亚态小鼠模型。在最高静脉注射剂量的LNP-mRNA制剂下，没有临床化学发现，但80%小鼠的脾中央动脉旁淋巴细胞轻度减少。这种效应归因于LNP，而不是hMUT mRNA或其表达，在携带绿色荧光蛋白（eGFP）的mRNA的LNP中也观察到了这种效应。
在另一项研究中，编码人精氨酸酶的修饰mRNA被用于治疗精氨酸酶缺乏症的小鼠模型。虽然没有生化或组织病理学发现，但接受荧光素酶mRNA单一对照制剂组的肝脏切片电子显微镜检查显示，存在亚微米大小的脂滴。
此外，单次肌肉注射编码流感血凝素H3抗原的LNP-mRNA制剂在兔子模型中显示出AST、ALT和C反应蛋白水平升高。肝脏组织病理学检查结果包括局灶性肩胛下空泡、炎性细胞和红细胞浸润，并在脾脏的生发中心观察到细胞增多（淋巴细胞扩增）。
总之，静脉注射和肌肉注射LNP-mRNA后可能出现肝脏或脾脏毒性或致病性，肝细胞对脂质成分的摄取似乎能够干扰脂肪酸和脂质的递送。
人体对纳米药物的不良免疫反应，包括疫苗接种后的反应原性、超敏反应、全身补体免疫反应和细胞因子介导的反应等。对于处于临床前开发阶段的基于LNP-mRNA的疗法，此类事件可能会损害其安全性并降低治疗效率。然而，由于LNP载体固有的组成复杂性，确定给定LNP-mRNA复合物的哪些成分引起不必要的先天免疫反应以及哪些条件可能加剧它们（剂量、给药途径、预先存在的炎症等）并非易事。
1.TLR活化和细胞因子分泌
LNP-mRNA对TLR的刺激被认为是细胞因子产生的上游途径。在一项相关研究中，使用了脂多糖（LPS）处理小鼠诱导炎症，然后炎症小鼠接受单次静脉注射LNP-mRNA，并表现出IL-6，C-C基序趋化因子配体2（CCL2）和其他促炎细胞因子（血清中）以及C-X-C基序趋化因子配体2（CXCL2，肝脏中）的水平升高。当小鼠被给予空载LNP时，观察到类似的免疫反应。研究指出可电离阳离子脂质ALC-0315为最主要的免疫刺激成分。炎症表型在巨噬细胞耗竭小鼠以及 Tlr4−/−小鼠模型中消融。有趣的是，使用另外两种可电离阳离子脂质（DLin-MC3-DMA或C12-200）的mRNA制剂也观察到类似的发现。
这些结果提出了一个问题：若可电离脂质没有大量位于颗粒的最外层，那么LNP-mRNA复合物或其生物分子冠的哪些其他成分可能会刺激膜表面TLR？
图1. LNP-mRNA引起的细胞因子释放
在一项独立研究中，小鼠巨噬细胞体外LPS激活后TLR4和LNP-mRNA在内体中的共定位证实了LNP-mRNA制剂在预先存在炎症时会通过TLR4触发先天免疫系统反应的假设。在这些条件下，采用cKK-E12可电离阳离子脂质的LNP内体逃逸受损，而TLR4下游蛋白激酶R（PKR）的磷酸化部分导致胞质内mRNA的翻译减少。虽然未引入单独LNP进行对照，但这些与TLR4相关的发现指向脂质介导的生物学效应对递送效率的影响。
皮内给药基于ALC-0315的LNP配制的非编码聚胞嘧啶mRNA具有相似的促炎作用，尽管是局部的。单次注射后观察到编码促炎IL-1β、IL-6、CXCL和CCL蛋白的基因上调，RNA测序（RNA-seq）和基因集富集分析指出了RLR和TLR刺激以及炎症小体激活。空载LNP对照反映了相同的促炎表型，因此有人认为可能是可电离脂质触发了观察到的炎症。
在类似的实验中，皮内注射负载荧光素酶自复制mRNA的LNP导致了强大的IFNβ产生。此外，荧光素酶表达动力学似乎受到并发炎症反应的限制，这表明炎症反应将严重影响基于mRNA的药物的治疗效果（图1b）。其他可电离阳离子脂质已被证明可以引起较温和的先天免疫反应。
使用另一种专有的可电离阳离子脂质，重复静脉内施用LNP-mRNA编码因子IX不会导致小鼠血浆中TNF或IFNγ水平升高，但其他炎性细胞因子，如CCL2、IL-6、CCL4、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和趋化因子，如RANTES（调节激活的正常T细胞表达和分泌）短暂增加。
在一些研究中，促炎反应清楚地发现源自于mRNA。修饰后eGFP mRNA的皮内电穿孔诱导小鼠注射部位周围产生IFNβ，但尚不清楚是否完全由未纯化完全的dsRNA引起。
总体而言，TLR激活和促炎细胞因子的释放是LNP-mRNA引起的常见先天免疫系统效应，有时会引起强烈的不良反应并影响蛋白质翻译。可电离阳离子脂质激活TLR4是一种可能的上游起始事件，尽管确切的分子机制尚未得到诠释。其他因素也可能是引起或加剧所述炎症作用所必需的，可能取决于有效载荷、剂量或给药途径等。
2.炎症小体激活
炎症小体激活最近被确定为LNP-mRNA所诱导的独特先天免疫系统效应（图2）。细胞焦亡的典型途径需要启动信号来激活NF-κB并开始NOD样受体热蛋白结构域蛋白3（NLRP3）和 pro-IL-1β的转录，后者可能起源于TLR激活。次级信号启动NLRP3炎症小体的组装和激活。
在一项体外研究中，在体外将基于DLin-MC3-DMA的LNP-mRNA施用于骨髓来源的巨噬细胞后，NLRP3炎症小体激活导致mRNA转染效率降低。LPS用于提供启动信号，但mRNA也可能通过TLR激活促进启动。LNP-mRNA逃逸时溶酶体破裂和损伤相关分子模式作为次要信号。NLRP3激活可以紧接着从IL-1β释放、裂解的gasdermin D和caspase 1表达以及组织蛋白酶B的成熟推断。
图2. LNP-mRNA激活炎症小体
当使用DLin-MC3-DMA或SM-102配置的LNP-eGFP mRNA处理人外周血单核细胞（PBMC）时，IL-1β以及其他促炎细胞因子（如IL-6、CCL2、CCL4和TNF等）的释放急剧增加。值得注意的是，基于SM-102的空载制剂也引发了强烈的IL-1β分泌，这表明这些脂质为炎症小体激活提供了启动和激活信号。
初始化信号（priming signal）被认为起源于LNP-PRR的相互作用，LNP诱导的损伤相关分子模式提供了次要信号。鉴于可电离脂质LNP-mRNA制剂倾向于激活TLR并释放IL-1细胞因子，这是一个有效的假设。IL-1β释放可以介导MyD88的磷酸化，从而提供自分泌或旁分泌启动信号。
3.补体活化和超敏反应
血浆和细胞表面的补体蛋白是先天免疫系统的基本组成部分。补体激活，即一系列蛋白水解事件，支持致病物质或颗粒的吞噬清除。生物制剂和核酸疗法的出现，迅速将补体激活相关的免疫毒理学研究提升为药物开发中的常规实践。
致病性的鉴定是启动补体激活的上游通路，其中有三种途径：经典途径，由IgG或IgM的模式识别启动;替代途径，由补体蛋白C3中硫酯键的水解引发;凝集素途径，由甘露糖结合凝集素（MBL）和纤维胶凝蛋白PRR识别碳水化合物病原体相关分子模式识别启动。
LNP-mRNA制剂已被证明可以激活补体途径。在一项食蟹猴模型体内研究中，静脉内给予LNP-mRNA表达hEPO导致血浆补体蛋白C3a和C5b-9水平轻度和可逆升高。在另一项研究中，在补体活性人血清中孵育表达CD40L的LNP-mRNA后，C3b/c和可溶性C5b-9也升高。抗PEG IgM是补体激活所必需的，并且与LNP完整性的丧失有关。这些发现与先前的报道一致，即由于免疫球蛋白调理作用和补体激活，免疫细胞介导纳米药物制剂加速清除。
补体激活也可能导致罕见的假性过敏反应。在接种第一剂BNT162b2或SM-102 COVID-19疫苗后，报告了几例过敏反应病例。受影响的患者检测到高水平的C5a，但没有IgE，提示LNP引起的肥大细胞脱颗粒（全身性过敏反应发作的指征）未经历预先的致敏和抗原特异性IgE产生，但真正的过敏反应会检测到IgE的升高。这些发现指出了补体激活导致相关假性过敏（CARPA）事件的发生，在这种过敏中，肥大细胞脱颗粒不需要免疫球蛋白介导。
迄今为止，尚不清楚哪种疫苗成分可能导致C5a的释放。预先存在的抗PEG IgG或IgM可能触发了经典通路并导致了CARPA；又或者，经典途径可能在脂质进入细胞内电离时被激活。
超敏反应（HSR）也表现为静脉输注药物后引起的不良免疫事件。HSR通常很少见，但具有潜在危险性，因为它们可能发展为严重的过敏反应、心肌炎、喉咙肿胀、呼吸衰竭或血流动力学改变等症状。
从理论上讲，任何LNP-mRNA组分都可以引发HSR，但历史数据表明，PEG脂质是最具潜在反应风险的组分。当PEG部分与肥大细胞表面的抗原特异性IgE结合时，后者脱颗粒并引起所谓的I型速接型HSR的过敏反应。与I型HSR相比，如上所述，CARPA 是一种更严重的HSR类型，源于直接肥大细胞脱颗粒和过敏反应样症状。除了CARPA和I型HSR之外，还有更多类型的HSR反应（II-IV），但目前这些HSR（II-IV）在领域内没有特异性报告。
证明mRNA平台制药潜力的临床前研究正在以前所未有的速度发展。新型mRNA疗法的安全性和耐受性可以通过各种方式寻求，但降低mRNA药物和疫苗的风险依旧很复杂。设计优化兼具安全性和有效性的候选药物需要一种多学科方法，结合先进的体外毒性筛选方法、用于早期识别风险的组学数据集以及密切监测的不断变化的LNP和mRNA。
虽然前路漫漫、道阻且长，但LNP-mRNA的成功去风险是降低损耗和成本的关键，对于新兴的mRNA治疗领域来说，值得我们不断的投入与努力。
编译：Vergil
参考资料