弓形虫是一种胞内原虫，可感染温血动物，对免疫受损患者尤其危险。垂直传播和对动物的影响也令人担忧。弓形虫病对畜牧业和食品安全造成经济和健康风险。目前治疗弓形虫病的金标准是乙胺嘧啶和磺胺嘧啶联合用药，但治疗成功率仍然较低，而这种治疗还会引起显著的副作用——不仅可能导致叶酸缺乏状态，还可能造成罕见甚至致命的严重反应，如粒细胞缺乏症、史蒂文斯-约翰逊综合征、中毒性表皮坏死松解和肝坏死。
对于弓形虫来说，接种弓形虫病疫苗可能是一种有效和适当的医学预防措施，特别是对特定人群，如孕妇和艾滋病毒患者。尽管已经有家畜和牲畜的弓形虫疫苗上市，但针对人类感染弓形虫的疫苗仍在研发中。一种由改良的弓形虫株(S48)组成的减毒活疫苗(Toxovax®，MSD，新西兰)已在欧洲和新西兰等地区获得批准，旨在减少先天性弓形虫病对养羊业的损失。研究结果显示，弓形虫疫苗的开发和商业化应用于人类免疫是可行的。然而，由于弓形虫基因组、生命周期和菌株多样性的复杂性，理想疫苗的开发仍然面临巨大挑战。
中国浙江省杭州医学院基础医学与法医学院寄生虫病研究所、浙江省新型疫苗工程研究中心、浙江省生物技术疫苗重点实验室进行了一项关于弓形虫疫苗开发的研究，结果发表于NPJ Vaccines期刊。
抗T.弓形虫疫苗
自上世纪中叶以来，弓形虫疫苗的研究经历了不同的阶段，主要有灭活疫苗、排泄-分泌抗原疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、表位疫苗和mRNA疫苗(图1)。虽然这些疫苗在预防和治疗弓形虫病方面可以发挥特殊的作用，但也存在一些问题。
图1.抗T.弓形虫疫苗
速殖子产生的排泄分泌抗原(ESA)是循环抗原的主要成分。ESA免疫可以提高动物的存活率，并减少感染弓形虫后的组织囊形成。然而，ESA免疫并不能完全提供免疫保护。与β受体拮抗剂普萘洛尔和铝佐剂混合物免疫相比，ESA表现出更好的保护效果，能够延长小鼠的存活时间。
弓形虫减毒株是通过伽玛辐照、化学处理和多次传代等方法获得的。这些减毒株在宿主体内引发免疫反应，产生记忆细胞并预防再次感染。目前市场上只有一种名为Toxovax®的减毒活疫苗可用于减少先天性弓形虫病对养羊业的危害。该疫苗采用改良的弓形虫菌株(S48菌株)，该菌株失去了形成卵囊的能力。
T-263是一种经化学诱导的弓形虫突变株，具有免疫原性，但无法在猫体内形成卵囊。据报道，喂食T-263活缓殖子的猫在遭受产生卵囊的菌株攻击后无法排出卵囊。
随着基因编辑技术的快速发展，CRISPR/CAS9技术成为一种革命性、强大而精准的基因组编辑工具。利用CRISPR/CAS9系统，我们可以精确地敲除特定基因，表达出所需要的相关功能缺失。通过控制和改变弓形虫生长和繁殖所需的物质，使生产弓形虫减毒活疫苗成为可能。研究发现，敲除特定基因的弓形虫株能够阻止野生型弓形虫卵囊的释放，并引发宿主产生免疫反应。
目前的研究显示，减毒活疫苗是最有效的弓形虫疫苗策略。然而，减毒活疫苗也面临些许挑战，例如保质期短、处理安全问题、伦理原因和安全性问题，因此不适合在人类中使用。此外，减毒疫苗可能会重新恢复为野生型，导致疾病的发生。
弓形虫亚单位疫苗主要利用弓形虫的部分成分进行制备。现已有对多种亚单位疫苗进行了研究，其中包括重组热休克蛋白70(RTgHSP70)免疫，可以刺激巨噬细胞产生一氧化氮，从而减少脑囊肿的发生。多表位设计的亚单位疫苗也具有研究价值。利用纳米颗粒作为载体可以提高对弓形虫的免疫保护效果。亚单位疫苗的主要缺点是免疫保护效果有限，通常需要使用载体或佐剂来进行递送。
（1）DNA疫苗
大多数DNA疫苗都是基于寄生虫毒力相关的蛋白质。这些蛋白质包括杆状病毒蛋白(ROP)、致密颗粒蛋白(GRA)、微粒蛋白(MIC)和表面抗原(SAG)，是DNA疫苗的主要组成部分。这些蛋白在弓形虫的细胞入侵、寄生和毒力中发挥关键作用。DNA疫苗通过诱导Th1型免疫反应，产生细胞因子IL-22、IL-2、IL-5和干扰素-γ，延长小鼠的存活时间。ROP16和GRA-24的DNA疫苗表现出良好的免疫效果。MIC和SAG蛋白参与寄生虫的黏附和侵袭，MIC8和SAG1的DNA疫苗能够诱导体液和细胞免疫反应，并产生保护性细胞因子IL-15和IL-21。综合而言，这些DNA疫苗有望提供对弓形虫感染的保护效果。
虽然许多DNA疫苗在价格、管理和低剂量下诱导强烈免疫反应方面具有优势，但仍然存在一些障碍。例如，大型动物的免疫反应往往较弱，需要比小型动物高1000倍的剂量才能达到有效的免疫效果。此外，质粒基因组可能潜在地整合到宿主基因组中，可能激活癌症相关蛋白并在DNA疫苗本身中产生抗体。
（2）表位疫苗
弓形虫具有复杂的生命周期，需要利用多个表位设计疫苗。多表位疫苗在保护效果上优于单表位疫苗。麦克劳德团队在疫苗原型的临床试验方面取得了重要进展。他们利用弓形虫自组装蛋白纳米颗粒(SAPN)诱导小鼠产生强烈的免疫反应，并延长小鼠的存活时间。研究还发现，多表位疫苗能够增强免疫反应、提高存活率和抗体效价。以表位为导向的疫苗具有较低的生物危害风险，可以设计和优化表位结构，以针对性增强免疫力。研究的重点是提高疫苗的免疫原性和稳定性。
（1）基因疫苗
mRNA疫苗利用特定的递送系统将编码弓形虫抗原的mRNA引入宿主机体，从而激活宿主产生免疫反应，获得保护性免疫。实验证明，这种疫苗在小鼠中展现出良好的免疫效果，减少了囊肿数量并延长了存活时间。相较于其他疫苗形式，mRNA疫苗具有多个优势，如克服了蛋白表达过程中的折叠问题、适应应对病原暴发的需求、相对安全、生产时间短等。然而，mRNA疫苗的细胞内半衰期较短，需要通过脂质体等载体传递。
（2）糖结合疫苗
在弓形虫感染中，糖偶联起着重要的作用。弓形虫的蛋白质通过与糖结合，实现稳定和运输，在其生命周期中十分关键。糖结合抗原被免疫系统识别，引发特异性抗体产生，因此成为疫苗开发的目标之一。然而，糖结合疫苗的免疫反应往往不足以抵抗致死剂量的弓形虫速殖子。糖结合疫苗的免疫原性较低，难以激发高亲和力的抗体，同时可能导致自身免疫反应。因此，在研究和开发糖结合疫苗时需要更加深入的探索和改进。
（3）外显体疫苗
外显体可以通过直接刺激T细胞或被其他抗原呈递细胞(APC)捕获，迁移到肠道基底膜，并传递抗原信息给免疫细胞，从而激活免疫反应。最新研究发现，从弓形虫中分离的外显体能够引发体液和细胞免疫反应，并控制小鼠的急性感染。一种无细胞疫苗，由DC2.4细胞衍生的外显体组成，能在体内诱导Th1型免疫反应，提供出色的弓形虫特异性抗感染保护。然而，外显体疫苗面临着一些挑战，如质量控制、不一致的纯化标准、制造、储存和管理监督不足以及生物相容性问题。这些问题需要得到解决，以便广泛应用于临床和大规模免疫计划。
弓形虫疫苗开发面临的挑战
在后基因组时代的进展中，生物信息学、基因组学和蛋白质组学等领域的发展可能有助于识别和选择新的有效抗原，从而应对未来的挑战。然而，未来的研究仍需解决一系列限制因素，如佐剂选择、方法优化、标准化免疫方案的制定、评估标准的建立、寄生虫株的选择、疫苗构建的优化，以及针对不同动物模型的研究。这些方面的进展将为弓形虫疫苗研究提供更全面和系统的基础(图2)。
图2.弓形虫疫苗开发面临的挑战
注：后基因组时代指的是在基因组测序完成后，基于基因组信息进行深入研究的时代。
由于弓形虫具有复杂的生命周期，涉及多个宿主，并以不同的蛋白质形式表达不同的入侵途径，因此表现出高度的抗原性多态性和变异性。弓形虫在其生命周期中的不同阶段具有不同的抗原组成，包括速殖子、缓殖子或卵囊。因此，在疫苗的开发中，应考虑到不同阶段的抗原。结合来自不同阶段的抗原的组合是可取的，这比仅使用单一抗原更为有效。理想的弓形虫疫苗应涵盖CD8+、CD4+和B细胞表位，以充分覆盖弓形虫在不同阶段的免疫原。
弓形虫株分为三个主要谱系，即I型、II型和III型，主要分布在北美和欧洲。尽管它们具有相似的遗传背景，但其毒力和致病机理存在差异。
I型菌株具有最高的毒力和致命性，感染剂量来源于单个活体。
II型和III型的毒力较弱。
还发现了一种名为12型的克隆谱系，该谱系在北美的野生动物中被发现。通过遗传分析技术，已经报道了一个描述和解释弓形虫进化分化的系统，该系统使用三组独立的多态DNA标记对数千个分离株进行基因分型。
根据标记遗传多样性揭示的138个独特的基因型被聚为15个单倍群，共同定义了6个主要分支。弓形虫菌株的多样性意味着以一种菌株为基础的疫苗可能对其他基因型的菌株无效，因此需要开发能够针对大多数弓形虫株有效的疫苗。一种方法是通过分析多态抗原蛋白的序列以及宿主的免疫反应来设计多等位基因疫苗，以诱导对多种菌株的抗体。类似的方法已经在疟疾疫苗的开发中得到应用。在弓形虫中发现了类似恶性疟原虫顶膜抗原1的蛋白，这表明一种包含少量等位基因的疫苗可能足以覆盖大多数自然传播的菌株。
弓形虫通过多种机制干扰宿主免疫系统，以逃避免疫监视。它通过竞争底物、改变染色质状态和阻断信号通路等方式，干扰宿主细胞的正常免疫反应。同时，弓形虫通过分泌特定蛋白质和调控细胞磷酸化等手段增强自身的毒力和生存能力。此外，弓形虫还通过抑制核因子-κB的功能和干扰巨噬细胞移动抑制因子等途径，调控宿主免疫反应。深入研究弓形虫与宿主相互作用的关键分子，对于深入了解其遗传学、免疫逃逸和疫苗开发具有重要意义。
弓形虫作为一种寄生虫，通过形成囊壁来逃避免疫系统的清除，从而延长感染期。最近的研究发现，一个名为BFD1的基因在弓形虫的分化过程中扮演着重要的角色。研究人员认为，利用BFD1可以增强弓形虫疫苗的免疫保护效果，从而有助于预防和治疗慢性感染。这一发现为进一步开发弓形虫疫苗提供了新的方向。
实验室小鼠是研究弓形虫感染的常用模型，但与人类存在物种差异，因此实验结果不能直接应用于临床实践。为了更好地研发弓形虫疫苗，转基因小鼠模型可能会提供帮助，但目前的模型仍存在一些限制。为了更准确地模拟人类的免疫反应，需要构建具备人类白细胞抗原基因特性的双转基因小鼠模型，以更好地研究和评估疫苗的效力和安全性。这将为弓形虫疫苗的开发提供更可靠和可行的平台。
目前，弓形虫疫苗的研发已经进入了亚单位疫苗和基因工程疫苗阶段，但大多数疫苗的免疫效果尚显薄弱。因此，为了增强疫苗的免疫反应，需要采用合适的佐剂。常见的佐剂包括铝盐、Toll样受体激动剂、脂质体、免疫刺激复合体(ISCOM)和CpG寡聚核苷酸等。然而，佐剂的使用也带来了一些新问题，例如铝盐佐剂易被非免疫细胞吸收，导致免疫保护效果不佳；而Toll样受体激动剂佐剂可能助长了病原体对宿主免疫系统的逃避。因此，联合使用多种佐剂来克服使用单一佐剂所带来的缺点是值得考虑的方向。
由于弓形虫的不同毒株、接种途径和剂量，以及不同的动物模型，使得比较不同候选疫苗的效力变得困难。不同实验室之间的比较也存在一定的难度。因此，建立疫苗开发的标准化方案迫在眉睫。这样的标准化方案将有助于确保不同实验室之间的结果可对照性，为疫苗的评估和进一步的研究提供一致的基准。这样的努力将进一步推动弓形虫疫苗的开发，并提高其疗效和可靠性。
当人类或其他宿主暴露于自然环境中时，可能会遭受多种病原体的感染。弓形虫感染会诱导Th1型免疫反应，而其他病原体，如蠕虫，则可能引发Th2型免疫反应。这种混合感染对于弓形虫疫苗的开发构成了重大挑战，研究人员必须对其进行充分评估。
目前，唯一商业化的疫苗是绵羊使用的速殖子S48减毒株（Toxovax®），该疫苗可降低绵羊的流产和新生儿死亡率，并提高羔羊的初生重量。然而，由于该疫苗基于细胞培养，其保质期较短且生产成本较高。因此，该疫苗的安全性和成本效益仍存在争议，目前仅在英国、新西兰、法国和爱尔兰等地使用。对于农民来说，弓形虫感染的治疗方法多种多样，可能缺乏购买疫苗的动力。
研究发现，通过对猫进行统一的的弓形虫疫苗接种策略，可以有效减少弓形虫在环境中的污染。一项研究对弓形虫菌株进行改造，使其受精能力受损，繁殖力下降，从而阻止了猫感染后卵囊的排泄。虽然对疫苗接种计划的成本效益分析模型尚不完善，但降低疫苗的成本有助于提高疫苗的应用率，降低家猫种群的感染率。然而，预防人类弓形虫病由卵囊引起需要广泛的疫苗接种覆盖范围，并且对于大型猫科动物效果尚不明确，目前只针对小型猫科动物有效。
弓形虫感染在温血动物中普遍存在，并对人类和牲畜构成持续威胁。由于弓形虫广泛分布于自然水源中，根除感染几乎是不可能的。因此，疫苗的研发成为治疗和预防措施的重要补充，而非替代品。为了制定有效的疫苗接种计划，需要经济学家和统计学家的合作，以便将资源聚焦于高风险人群。减毒活疫苗目前被认为是最有效的选择，而CRISPR技术为产生具有基因缺失突变的弓形虫株作为活疫苗提供了全新的途径。
结论
尽管弓形虫疫苗的开发面临着种种挑战，但我们依然可以对此保持乐观态度。弓形虫疫苗的开发已取得相应进展，但寻找新的疫苗接种策略仍然具有挑战性。弓形虫疫苗的开发受到其复杂的生命周期、临床翻译困难以及缺乏标准化平台的影响。候选疫苗包括重组抗原、多表位抗原、DNA或RNA疫苗以及微粒疫苗，并已在动物模型中进行了研究。未来的研究应选择具有较高免疫原性的抗原，构建多抗原疫苗，并对适当的佐剂和递送系统进行评估，研究弓形虫疫苗接种方案对于特定人群的成本效益评估也至关重要。
参考文献：Zhang Y, Li D, Lu S, Zheng B. Toxoplasmosis vaccines: what we have and where to go? NPJ Vaccines. 2022 Oct 31;7(1):131. doi: 10.1038/s41541-022-00563-0. PMID: 36310233; PMCID: PMC9618413.