仇子龙/程田林团队成功利用全脑单碱基编辑技术，改善孤独症小鼠核心症状

牛煦然博士，魏文胜教授（北京大学）

孤独症谱系障碍（Autism spectrum disorder, ASD）（亦称“自闭症”）是一类神经发育障碍性疾病，患者往往有社交、语言等方面的障碍，并会存在重复刻板的行为。随着1988年著名电影Rain Man的上映，这一疾病更加为人所知。目前，ASD已被明确报道存在高度遗传倾向。在包括中国和韩国在内的东亚ASD人群队列研究中，MEF2C这一基因的突变已经被发现和ASD发病相关。MEF2C在小鼠神经元分化、神经发育和突触可塑性中发挥着重要作用，暗示这一基因可能通过影响神经系统发育而产生ASD疾病表型。

近日，上海交通大学医学院松江研究院/中科院脑智卓越中心仇子龙课题组与复旦大学脑科学转化研究院程田林课题组合作在Nature Neuroscience上发表了题为Whole-brain in vivo base editing reverses behavioral changes in Mef2c mutant mice的研究论文。该文章通过全外显子组测序在患者中发现了MEF2C基因上的一个de novo SNV（c.104T > C, p.L35P），并证实了该突变会影响MEF2C的泛素化降解途径进而影响蛋白水平。MEF2C-L35P敲入的杂合小鼠会出现明显的新事物识别障碍、多动、重复行为等ASD表型。由于该突变恰好可以被胞嘧啶碱基编辑器CBE所纠正，因此研究人员使用优化的APOBEC内嵌型CBE（AeCBE）结合双AAV递送的方式对Mef2c L35P+/-小鼠进行了in vivo基因编辑治疗，成功纠正了小鼠所存在的类ASD疾病表型。

本论文可圈可点之处，第一是在小鼠上精确模拟了人群中存在的SNV并得到了相似的ASD表型，为进一步的研究提供了良好的模型基础；第二是使用优化的AeCBE进行编辑，不仅比AncBE4等编辑器效率更高，还使用了PAM为NGN的SpG Cas9，拓宽了编辑器的使用范围；第三是使用了可以突破血脑屏障的AAV-PHP.eB，高效地将编辑系统递送至小鼠全脑；第四是概念上证明了碱基编辑器可以通过一次给药的方式，对脑部遗传疾病进行精准且有效的基因治疗，为未来ASD及相关遗传疾病治疗提供了良好的思路与范式。近期，仇子龙课题组还和上海交通大学医学院附属新华医院李斐团队报道了中国孤独症人群的大规模全外显子遗传学研究。研究中所鉴定的多个高置信度的ASD候选基因及对应的相关突变都有使用相似策略进行研究和治疗的价值。在今年3月，David Liu课题组也在Science上发文，使用双AAV9载体递送ABE编辑系统对脊髓型肌萎缩症（SMA）小鼠进行了治疗。该策略主要针对脊髓运动神经元，同样可以实现一次给药，终身治愈的目的。

当然在未来，对于脑部遗传病的基因治疗还可以有更多优化选择策略，比如针对需编辑的致病位点多样性，可以选择不同PAM的Cas9进一步拓宽使用范围；可以使用AAV-PHP.eB进一步优化得到的AAV.CAP-B10血清型进行更为高效精准的神经元递送，或针对具体需求使用AAV-MG1.2等更加亲和小胶质细胞的血清型进行递送。除CBE之外，ABE编辑系统以及近期报道的多个基于ABE系统TadA脱氨酶进化得到的新型CBE、CGBE、ACBE等编辑工具均有望在遗传疾病的治疗中得到应用。基于ABE系统的编辑器整体安全性（包括脱靶效应在内）比CBE更好，且有的变体具有良好的A5、C5等位置的窄窗口编辑效果，对于以治疗为目的精准编辑更为有利。与此同时，由于ABE的整体系统更小，可以包装入单个AAV内，因此ABE系统和如直接进化TadA所得到的TadCBEs工具也有极大的in vivo基因治疗潜力。

或许在未来，我们身边的Rain Man，可以在飞速发展的基因编辑工具的应用浪潮中，拥有Healthy Brain，成为走出孤独世界的Brave Man。

李大力教授（华东师范大学）

人类致病性遗传突变中有近6成为点突变，虽然基于CRISPR的HDR技术提供了碱基突变修复的可操作性，但受外源模板、修复机制等影响，HDR的编辑效率仍非常有限。此外，HDR介导的基因编辑往往依赖于细胞分裂，其应用潜力更加受限。近年来， CRISPR衍生技术-碱基编辑器（BE）已成为广受欢迎的碱基高效替换工具，它主要由Cas蛋白与脱氨酶或DNA损伤修复酶构成，如CBE, ABE, CGBE/GBE 以及最近开发的腺嘌呤颠换编辑器（AYBE, AXBE, ACBE）等。因无需依赖外源模板和DSB，理论上也不依赖于细胞分裂，碱基编辑技术已广泛应用于生命科学的众多领域，特别是基于血红蛋白病、早衰症、视网膜病变、神经肌肉病、心肌病、耳聋等疾病的基因治疗。

遗传变异是导致多种神经系统疾病发生的关键因素，因此能精准修复致病突变的基因编辑技术在其中的治疗潜力也广受关注。考虑到神经元在出生后很快失去分裂能力的特点，BE较HDR在神经系统疾病治疗中更具有应用的潜力和可行性，但BE是否真能用于逆转大脑的致病突变而治疗神经发育障碍疾病（如自闭症），目前尚未有相关报道。

近期发表在Nature Neuroscience的工作中，仇子龙和程田林团队合作首次鉴定了一个诱发自闭症的罕见致病点突变(c.104T>C, p.L35P)，该位点位于MEF2C基因MADS结构域上，对于维持MEF2C蛋白稳定性以及神经元发育非常重要。研究者还发现，携带该致病点突变的小鼠中也出现了神经发育异常和自闭症样的行为表型，表明成功获得了自闭症疾病模型。为实现该致病位点的有效纠正，作者结合Cas9广谱突变体SpG、脱氨酶APOBEC3A的高安全性突变体以及内部嵌入策略，开发出了新型CBE工具-AeCBE。通过与经典的CBE进行对比，作者发现AeCBE在含有致病突变的小鼠原代皮层神经元中具有最优的胞嘧啶转换编辑效率，证实了碱基编辑器用于非分裂细胞神经元致病突变修复的可行性。最后使用内含肽介导的拆分策略以及穿过血脑屏障(BBB)的AAV-PHPeB系统进行体内递送，发现AeCBE在全脑Mef2c产生了高效的C-to-T编辑（~20%）且具有较低的脱靶风险。该治疗能有效恢复Mef2c蛋白的表达水平，并有效改善了自闭症小鼠的突触功能和社交能力，也显著降低了重复刻板行为的出现。

总之，这项工作发现了导致自闭症的MEF2C致病新突变，探索了新突变的致病机理，还创新性开发出高效且更少旁观者突变的AeCBE系统，最终通过在体全脑碱基编辑首次实现了自闭症小鼠的有效治疗。该研究为自闭症治疗提供了新的思路，并进一步表明了碱基编辑技术治疗遗传性脑部疾病的巨大潜力。

朱俊杰博士、陈佳研究员（上海科技大学）

自闭症谱系障碍（ASD）是一种具有高度遗传性的神经发育障碍，表现为社交缺陷，以及重复或受限的行为1,2。目前为止，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准使用一些非典型抗精神病药物治疗自闭症患者，例如利培酮（Risperdal）和阿立哌唑（Abilify），但往往伴随着一些副作用。

有研究结果表明，MEF2C基因在成年小鼠的大脑皮质、海马体和杏仁核中大量表达3，其能够调节突触可塑性和谷氨酸能突触的数量，是ASD相关基因网络的调节基因之一4。MEF2C的突变会导致儿童大脑发育缺陷，其特征为精神运动障碍，缺乏言语，异常运动模式等5,6。

基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统已被广泛应用于研究和治疗各种遗传疾病，如遗传性转甲状腺素淀粉样变性（hATTR）7、遗传性血管性水肿（HAE）、阿尔兹海默症（AD）8和亨廷顿舞蹈症（HD）9等。但碱基编辑仍没有得到广泛应用，尤其在神经发育障碍治疗领域。

仇子龙/程田林团队在最新发表的论文 Whole-brain in vivo base editing reverses behavioral changes in Mef2c mutant mice，为遗传性神经发育障碍的治疗提供了新的思路。研究团队首先在ASD患者中鉴定出MEF2C基因中一种新的SNV(c.104T>C, p.L35P)，构建了Mef2c L35P+/-自闭症谱系障碍小鼠模型，并进一步研究Mef2c L35P突变对小鼠的影响。为了纠正这一突变，研究团队在SpG蛋白内部融合了人胞苷脱氨酶APOBEC3A-Y130F10和尿嘧啶糖苷酶抑制剂（UGI），从而构建了一种新的CBE工具- AeCBE。其具有编辑效率高，旁观者编辑（bystander）和脱靶编辑（off-target editing）低等优点。随后，作者们采用可穿过血脑屏障的双AAV系统（AAV-PHP.eB）和内含肽介导的拆分策略，将AeCBE系统递送至Mef2c L35P+/-小鼠模型中。通过NGS、免疫染色、行为学分析，电生理等手段，验证了AeCBE能够在小鼠模型中高效编辑靶向位点，并纠正Mef2c L35P+/-小鼠的自闭症行为。

目前，自闭症的治疗是医学中的难点之一，尚没有特效药能够治疗自闭症。而在本研究中，作者们在前期报道的hA3A-BE3-Y130F碱基编辑器的基础上构建了一种新的CBE系统，能够在ASD小鼠模型中纠正MEF2C(c.104T>C)点突变，并纠正其自闭症行为。虽然ASD的成因极其复杂，但这项研究证明了体内碱基编辑在神经发育障碍治疗中的潜力，同时也为其他类型的碱基编辑器在脑内递送以及编辑带来了新的启发。