导读
胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）是中枢神经系统发病率和死亡率最高的原发恶性肿瘤，虽经外科手术辅以同步放化疗的综合治疗，GBM患者的中位生存期仅为16-18个月，5年生存率低于10%。
受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases, RTKs）是细胞膜表面蛋白家族，通过信号转导参与调节重要的细胞功能，包括细胞生长和蛋白质合成。RTK/PI3K/AKT通路的过度激活是GBM病理机制的典型分子标志。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）扩增、过表达和致病突变在GBM中常见。值得注意的是， EGFR-vIII突变在没有任何配体刺激的情况下具有组成型酪氨酸激酶活性。伴有EGFR扩增和EGFR-vIII突变的GBM与更高恶性程度相关。虽然过度激活的EGFR通路在脂肪生成和胆固醇摄取中发挥作用，但EGFR通路是否参与脂肪酸代谢和能量生成尚不清楚。
细胞代谢的重编程是肿瘤发生的另一个病理标志，支持肿瘤细胞对能量的高需求，促进肿瘤抑制免疫微环境的建立。脂质、氨基酸和核苷酸代谢异常以及糖酵解增强在GBM细胞中常见。有趣的是，高水平的细胞胆固醇在肿瘤细胞存活和疾病进展中起着至关重要的作用。然而，抑制脂质代谢和(或)降低胆固醇水平对GBM细胞代谢重塑的实际影响尚需进一步研究。
在本研究中，课题组通过对GBM样本的单细胞RNA测序和公开数据库的大量转录组分析，证明了EGFR的表达与脂肪酸合成代谢关键酶ACSS3、ACSL3和ELOVL2呈正相关。GFAP、CHI3L1和EGFR高表达GBM样本中的脂肪酸代谢和胆固醇水平均高于低表达组。一系列体外和体内实验表明，同时抑制EGFR/AKT通路和胆固醇合成可以影响三羧酸循环（TCA）、减少ATP产生，从而通过促进细胞毒性T淋巴细胞浸润抑制GBM生长。机制上，靶向甲羟戊酸通路降低了GBM膜上EGFR的水平，抑制EGFR/AKT信号轴，进而降低了ACSS3、ACSL3和ELOVL2的表达。通过整合GFAP、CHI3L1、OLIG2、SOX6、ACSS3、ACSL3、ELOVL2基因表达谱，构建RTK-脂肪酸评分系统（RFA score），不仅可以评估GBM患者的预后和生存，而且可以为高评分GBM患者提供多靶点联合治疗，从而改善预后和延长生存时间。
图1. EGFR高表达伴ACSS3、ACSL3、ELOVL2表达的GBM患者预后较差
GBM细胞瘤内和瘤间高度异质性，表现为细胞群和细胞周期状态的多样性，导致对常规治疗不敏感，预后差。为了更好地了解GBM微环境的复杂性，我们采用多点采样的方法收集了5例GBM患者的14个肿瘤组织样本，使用BD Rhapsody系统进行单细胞RNA测序文库的构建。经过一系列严格的细胞质控分析，将细胞注释为7种亚型，其中绝大多数细胞为致瘤细胞，占细胞群的69.22%，其他细胞类型包括巨噬细胞(10.76%)、少突胶质细胞(6.17%)、中性粒细胞(5.60%)、T细胞(4.32%)、平滑肌细胞和成纤维细胞(smc和fibro;3.37%)和内皮细胞(0.56%)(图1A)。我们重点关注占比最大的肿瘤细胞(共43,215个细胞)，使用UMAP进行重新分析和可视化，通过鉴定成簇的标记基因，追踪不同肿瘤细胞类型的基因表达特征。基于星形胶质细胞标志基因GFAP、间质性GBM标志基因CHI3L1、前神经元性GBM标志基因OLIG2和SOX6的表达特征，易于区分肿瘤细胞。此外，我们鉴定了大量GFAP和CHI3L1阳性的细胞，并显示EGFR和PDGFA的高表达水平。因此，根据这些基因的表达谱和分布模式，将肿瘤细胞分为4个不同的细胞群:CP1 (GFAP+CHI3L1+EGFR+PDGFA+OLIG2-SOX6-)、CP2 (GFAP+CHI3L1+EGFR-PDGFA-OLIG2-SOX6-)、CP3 (GFAP-CHI3L1-EGFR-PDGFA- olig2 +SOX6+)和CP4 (GFAP-CHI3L1-EGFR-PDGFA-OLIG2-SOX6-;图1B-C)。基于GFAP、CHI3L1、OLIG2、SOX6、EGFR和PDGFA的表达谱，我们将来自CGGA队列的胶质瘤患者分为3组:G1组GFAP和CHI3L1高表达，同时RTK通路激活(EGFR和PDGFA基因高表达);G2组除RTK通路失活(EGFR和PDGFA基因低水平激活)外，其他基因表达谱与G1组相似;G3组的特征是OLIG2和SOX6的高表达水平。Kaplan-Meier生存分析显示，具有G1特征的患者总生存时间最短，而具有G3特征的患者生存时间最长，具有G2特征的患者生存时间中等(图1D)。通过鉴定每个群体的差异表达基因(图1E)，我们注意到酰基辅酶a合成相关基因(ACSS3, ACSL3和ELOVL2)在CP1亚组中富集(图1E)，这意味着GBM中的RTK通路激活可能伴随着强烈的脂肪酸生物合成和代谢。利用CGGA数据库中的胶质瘤队列进一步验证了这些基因之间的正相关性(图1F)。由于上述基因的表达具有正相关性，且具有较大的预后价值，我们试图整合它们的表达谱，构建GBM患者的RFA网络，用于聚类和预后预测。Kaplan-Meier曲线显示，RFA评分高的患者总生存时间缩短(图1G)。
图2. EGFR/AKT通路的激活通过NF-κB激活促进ACSS3、ACSL3和ELOVL2的表达
鉴于EGFR和脂肪酸代谢相关基因之间的正相关，我们假设ACSS3、ACSL3和ELOVL2的表达可能受到EGFR/AKT通路的转录调控。为了证明这一假设，我们使用了GBM细胞系U-87 MG和具有内源性EGFR-vIII杂合突变的原代GBM细胞TBD0220，来研究在激活或抑制EGFR/AKT通路时ACSS3, ACSL3和ELOVL2的表达模式。如图2A所示，在U-87 MG细胞中，EGF刺激或EGFR-vIII突变体过表达后，ACSS3、ACSL3和ELOVL2的表达水平显著升高。AKT抑制剂MK-2206也可降低TBD0220细胞中上述基因的表达。研究表明，EGFR/AKT通路驱动的NF-κB信号活化在GBM的肿瘤发生和转移中起着重要作用。我们发现NF-κB可被过表达的EGFR-vIII突变体磷酸化，并被MK-2206去磷酸化，表明这些基因之间的调节关联(图2B)。在EGFR-vIII过表达的U-87 MG (U-87 MG-EGFR-vIII)和TBD0220细胞中，NF-κB抑制剂JSH-23通过降低磷酸化NF-κB (p-NF-κB)的水平来抑制ACSS3、ACSL3和ELOVL2的表达(图2C)。ChIP分析进一步表明，这些基因启动子的p-NF-κB的富集在EGFR/AKT通路激活后显著增加，而在MK-2206处理后下降(图2D-F)。综上所述，这些结果表明，EGFR/AKT通路的过度激活可以通过NF-κ b依赖的转录激活来增强ACSS3, ACSL3和ELOVL2基因的表达。
图3. EGFR/AKT通路调控GBM细胞线粒体呼吸和增殖
为了进一步分析EGFR/AKT通路抑制条件下能量代谢重编程的机制，我们使用Seahorse实验来评估MK-2206刺激TBD0220和U-87 MG细胞后的代谢变化。结果表明，与对照细胞状态相比，MK-2206处理后，U-87 MG-EGFR-vIII细胞的氧耗率(OCR)增加，但TBD0220和U-87 MG-EGFR-vIII细胞的OCR均降低(图3A-B)。基础呼吸、质子泄漏和ATP生成速率的变化与这些细胞系的OCR一致(图3A-B)。此外，ATP检测结果表明，在EGFR-vIII过表达的U-87 MG细胞中，ATP产量增加，但在TBD0220和U-87 MG-EGFR-vIII细胞中，MK-2206处理后，ATP产量显著降低(图3C)。细胞生长和集落形成实验表明，EGFR/AKT通路激活可以提高集落数量和GBM细胞增殖率，而这些作用在MK-2206处理的细胞中被逆转(图3D-E)。补充ATP可以部分挽救MK-2206引起的增殖抑制(图3D-E)。流式细胞术检测不同处理条件下GBM细胞的细胞周期分布，发现EGFR/AKT通路过度激活时，G0/G1期细胞进入S期的数量增加，MK-2206刺激后出现相反的作用(图3F)。细胞周期相关蛋白，如CDK2, CDK4, CDK6和Cyclin D的表达以及RB的磷酸化，呈现出EGFR/AKT通路激活的显著增加的变化，这可以被MK-2206减弱(图3G)。
综上所述，这些结果表明，EGFR/AKT通路可能参与了GBM细胞的能量代谢重编程，细胞增殖和细胞周期进程，而AKT抑制剂MK-2206可以阻断这些细胞的能量代谢重编程，细胞增殖和细胞周期进程。
图4. 在GBM细胞中，EGFR/AKT通路的过度激活与磷脂代谢和胆固醇生物合成加速相关
RTK信号通路，尤其是EGFR/PI3K/AKT轴，促进GBM脂肪酸生物合成和脂肪生成。考虑到EGFR/AKT通路的转录调控对ACSS3, ACSL3和ELOVL2基因表达谱的影响，我们注意到在GBM细胞中EGFR/AKT通路的激活可以诱导脂肪酸代谢相关的代谢重编程。为了研究EGFR/AKT通路过度激活的GBM细胞的代谢特征，我们从GBM患者中获取了66份新鲜样本，以询问代谢产物和转录组特征。联合分析表明，大多数检测到的磷脂酰胆碱(PCs)与EGFR、ACSS3、ACSL3和ELOVL2的表达增加呈正相关，而溶血磷脂酰胆碱(LysoPCs)与这些基因的激活呈负相关。在脂肪酸代谢相关基因差异表达的样本中，其他代谢物，如磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰丝氨酸(PS)的水平无显著变化(图4A-B)。此外，我们发现在GBM样本中，中链和长链脂肪酸的水平随着EGFR表达的上调呈比例增加(图4C)。
脂肪酸可通过β氧化途径分解代谢，产生乙酰辅酶a，而乙酰辅酶a是ATP生成的TCA循环的重要组成部分(图4D)。因此，我们应用一系列的抑制剂实验来探索抑制EGFR/AKT通路对能量代谢重构的影响。用MK-2206刺激TBD0220细胞，观察细胞内代谢物的变化。结果表明，与DMSO对照相比，在MK-2206处理下，TCA循环中的多种中间体减少(图4E-H)，导致ATP产量减少(图4I)。在MK-2206处理的GBM细胞中，山楂酸(C22: 0)(一种极长链脂肪酸(VLCFA))水平降低(图4J)。
值得注意的是，在EGFR表达较高的GBM样本中检测到胆固醇水平升高(图4C)。考虑到乙酰辅酶a催化转化为羟甲基戊二酰基辅酶a (HMG-CoA)对于甲羟戊酸途径和胆固醇生物合成都是必不可少的，我们试图探索MK-803处理抑制甲羟戊酸途径的TBD0220细胞的代谢变化。LC-MS分析显示，MK-803处理后的TCA循环中间体含量和山楂酸水平的变化与MK-2206刺激后的变化相似(图4E-J)。
综上所述，这些结果表明，EGFR/AKT通路的激活可能会增加各种脂肪酸和胆固醇的含量，从而使GBM细胞发生强大的能量代谢变化。
图5. MK-803通过降低细胞膜上EGFR水平抑制EGFR/AKT通路的转导
接下来，我们试图阐明甲羟戊酸途径参与GBM细胞代谢重塑的机制。鉴于胆固醇是细胞增殖和膜稳态的调节因子，我们分离了MK-803处理的TBD0220, U-87 MG和U-87 MG-EGFR-vIII细胞的细胞质内容物和膜成分。与DMSO对照组相比，用MK-803刺激GBM细胞后，细胞膜上的EGFR或EGFR-vIII群体显著减少，而补充胆固醇恢复了膜上的EGFR或EGFR-vIII水平(图5A)。然后，我们通过选择性配体激活法研究MK-803对EGFR/AKT通路的影响。TBD0220、U-87 MG和U-87 MG-EGFR-vIII细胞在MK-803处理后用不同时间的EGF刺激，表现出对EGF和EGFR/AKT通路转导的反应明显减弱，EGF刺激后AKT磷酸化水平迅速下降(图5B)。MK-803处理的GBM细胞中，ACSS3、ACSL3和ELOVL2的表达受到抑制(图5C)。
随后，我们检测了MK-803对GBM细胞能量代谢和细胞增殖的影响。MK-803处理显著降低TBD0220细胞中的OCR，并拮抗EGFR-vIII在U-87 MG细胞中的OCR增加(图5D-E)。MK-803处理的GBM细胞的基础呼吸、质子泄漏和ATP生成受到显著抑制(图5D-E)。MK-803处理TBD0220和U-87 MG-EGFR-vIII细胞后，细胞内ATP水平显著降低，细胞增殖率受到抑制(图5F-G)。
综上所述，这些结果表明MK-803抑制甲羟戊酸通路可以通过阻断EGFR/AKT信号转导和脂肪酸代谢相关基因的表达来重编程GBM细胞的能量代谢和抑制细胞增殖。
图6. 靶向EGFR/AKT和甲羟戊酸通路可抑制GBM增殖，延长荷瘤小鼠生存时间
TMZ是临床治疗恶性胶质瘤的一线化疗药物。我们评估了TMZ对MK-2206和MK-803的体内增敏作用。我们按照图6A所示的实验设计，对荷瘤小鼠进行化疗药物的灌胃给药。生物发光成像数据显示，与假对照相比，单药中断TMZ、MK-2206或MK-803均可抑制裸鼠移植瘤的生长，其中TMZ的抗肿瘤作用最明显。多药联合治疗的抑瘤效果优于单药治疗。TMZ、MK-2206和MK-803的组合对荷瘤小鼠显示出最佳的治疗效果(图6B-C)。Kaplan-Meier生存曲线显示，3种药物方案治疗的小鼠预后最好(图6D)。苏木素-伊红染色证实，与溶剂处理的假小鼠相比，治疗组的肿瘤负荷显著降低，这与生物发光的结果一致。免疫组化检测Ki67表达水平显示，治疗后裸鼠移植瘤的增殖能力受到抑制。在MK-2206、MK-803或不同药物组合处理的GBM小鼠中，ACSS3、ACSL3、ELOVL2的表达和AKT磷酸化受到抑制(图6E)。
图7. RFA评分与免疫抑制性GBM微环境呈正相关
鉴于脂肪酸代谢和胆固醇生物合成增强支持GBM生长和免疫抑制性微环境的形成，我们通过解析探究RFA评分与免疫细胞代谢之间的关系。我们发现RFA评分与免疫抑制呈正相关(图7A)。RFA评分与CASP4、ELF4、LIR1、LYN、MR1、MSR1、NFKB1、RAB27A、SWAP70、TGFB1表达(图7B)。通过采用单样本基因集富集分析(ssGSEA)，我们观察到RFA评分高的患者与免疫细胞谱系具有显著的强相关性(图7C)。为了进一步全面研究GBM中与RFA相关的免疫过程，我们使用ESTIMATE R包计算了胶质瘤队列的肿瘤纯度，结果表明RFA评分和肿瘤纯度呈负相关，这意味着RFA评分高的GBM可能具有更高的瘤内异质性和更多浸润的免疫细胞(图7D)。采用CIBERSORT算法分析肿瘤的免疫细胞组成。高RFA评分与M2巨噬细胞浸润增加相关，这代表免疫抑制(图7E)。综上所述，我们的结果表明，RFA评分可能为GBM肿瘤的免疫微环境状态提供有效的证据。
图8. TMZ + OSI + ATO的联合治疗策略可降低肿瘤增殖，改善GBM微环境
为了研究EGFR/AKT和甲羟戊酸通路抑制在体内GBM微环境调节中的作用，我们使用同基因CT2A细胞系，一个Pten缺陷的小鼠来源的GBM细胞系，在免疫正常的C57BL/6J小鼠中建立了颅内肿瘤模型。为了更好更快地将联合治疗策略应用于GBM的治疗，将AKT抑制剂MK-2206更换为已获批准用于临床治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的可渗透血脑屏障的第三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂(OSI)，将MK-803更换为可抑制甲羟戊酸途径的常用降胆固醇药物阿托伐他汀（ATO）。小鼠在CT2A颅内注射后通过胃内给药接受不同的药物组合(图8A)。生物发光成像监测显示，与DMSO对照组相比，TMZ、TMZ + OSI、TMZ + ATO和TMZ + OSI + ATO组的肿瘤生长显著下降(图8B-C)。联合用药较TMZ单独用药具有更好的肿瘤抑制效果。值得注意的是，TMZ + OSI + ATO方案在该动物队列中显示出最佳抗肿瘤结局(图8C)。考虑到ATO在临床上主要用于治疗高脂血症，我们在药物治疗的基础上建立了高脂饮食诱导的小鼠高脂血症模型。与普通饮食作为对照相比，TMZ治疗组的HFD显示肿瘤生长略有增加，而接受TMZ + OSI + ATO方案的HFD和普通饮食动物的肿瘤生长没有显著差异，这表明HFD的效果可以被ATO治疗抑制(图8C)。在TMZ + OSI + ATO和TMZ + OSI + ATO + HFD治疗的肿瘤中，巨噬细胞和肿瘤浸润的细胞毒性T淋巴细胞的M1/M2比值均显著增加(图8D-F)，这意味着抗肿瘤免疫应答增强。
图9. TMZ可协同ATO在临床GBM治疗中发挥抗肿瘤作用
为了进一步验证ATO使GBM对TMZ增敏的临床效果，我们检查了在北京天坛医院和河北大学附属医院接受标准治疗和随访的GBM患者。值得注意的是，这些患者因高脂血症病史而常规口服ATO。与未服用他汀类药物的GBM患者相比，每日口服他汀类药物的患者的OS和无进展生存期(PFS)显著延长(图9A-B)。如典型病例(患者1)所示，由于STUPP方案和长期TMZ联合ATO治疗，PFS延长至21个月，显著长于未使用他汀类药物的GBM患者的平均时间(图9B-C)。HE染色和Ki67染色显示，虽然原发GBM组织中EGFR水平显著升高，但以EGFR和AKT磷酸化为代表的EGFR/AKT信号激活仍处于低水平。此外，这些肿瘤组织样本的ACSS3、ACSL3和ELOVL2呈弱阳性，CD8+ T细胞和M2巨噬细胞呈轻度信号，这可能是由于患者1在首次诊断为GBM之前接受了每日口服ATO(图9D)。
综上所述，这些体内实验结果为OSI介导的EGFR/AKT通路抑制可以增强TMZ的肿瘤抑制作用提供了强有力的证据。此外，TMZ可以与OSI + ATO联合治疗的效果产生协同作用，使GBM患者，尤其是合并高脂血症的患者最大程度获益。
结论：该研究揭示了EGFR/AKT通路激活通过上调GBM细胞中ACSS3, ACSL3和ELOVL2的表达来促进能量代谢的调控机制。针对EGFR/AKT通路和胆固醇合成的抑制剂可以通过调节脂肪酸代谢相关基因的表达和降低膜定位的EGFR水平来逆转疾病表型。此外，我们利用多组学方法综合分析和利用多个数据库中的胶质瘤数据，基于胶质瘤的恶性程度和代谢特征建立了一个与代谢相关的RFA标签，可以预测患者的预后。此外，TMZ、辅助EGFR-TKI和他汀类药物的联合治疗策略可显著延长高RFA评分GBM患者的生存时间。