视频内容简介
Quantum-Si 公司提出的高通量蛋白质测序方案，目前已经可以测出长达10几个氨基酸残基的肽段的部分序列。本视频介绍了这种测序方案的原理，和它存在的问题。这个测序方法正在进一步的完善优化过程。预计未来会带来巨大的应用市场。
视频内容
大家好，欢迎来到【陈巍学基因】，今天我要讲的是《高通量蛋白质测序》。
这项技术有可能会和高通量 DNA 测序技术一样，又带来一波新的生物检测技术大发展。
今天要讲的这项技术，出自题为《Real-time dynamic single-molecule protein sequencing on an integrated semiconductor device》的这篇文章。这篇文章发表在 Science 杂志 2022 年的 10 月刊上。
文章的题目，翻译成中文意思是《在一个集成半导体设备上做实时动态的单分子蛋白测序》。
发表这篇文章的机构是 Quantum-Si 公司。Brian D. Reed 是 Quantum-Si 公司的技术负责人，也是这篇论文的第一作者和通讯作者。
接下来，我会分 4 个部分来讲这项技术。
先说第一部分，测序仪及测序芯片。
图中，是 Quantum-Si 公司的多肽测序仪。左边的这张图是测序仪的外观。右边的这张图，是仪器的分解图。中间可以看到放芯片的位置。
测序的过程是在专用的芯片上完成的。左边的两张图是测序芯片的外观样子。右边的图展示了芯片上的多个小孔。
据论文作者 Brian 自己介绍，一张芯片上有 200 万个小孔，检测反应就是在这些小孔中发生的。每个小孔中容纳的液体容量小于 5x10^-18 升。
这是测序芯片的构造。
上面是反应的小孔，这个反应小孔的直径很小，这可以保证只有在这个小孔中的荧光会被检测到，而漂散在上面液体中的荧光染料所发出的荧光，不会被检测到。
下面是检测光信息的像素点，一个像素点对应于一个反应小孔。
目前，这个芯片的感光像素点只能感知有没有接收到光，但不能分辨光的颜色。
通过光路可以让入射激光射进芯片，有反射镜和光栅耦合器来引导光路。
第二部分，我们来说测序原理。
这是测序的原理图，我们会逐段地进行讲解。
先把要测的蛋白质样本，用限制性蛋白内切酶进行切断。
切断后的多肽溶液，铺到芯片上。芯片小孔的底部有能与多肽的羧基端结合的化学物质，多肽的羧基端就会与小孔底部的这种化学物质共价结合。
每个小孔中能结合几条多肽，是符合泊松分布的。理想情况下，有 1/3 的小孔中结合了一条肽；另外，有 1/3 的小孔中结合了多条多肽；还有 1/3 的小孔中没有结合多肽。只有那些只结合了一条多肽的孔，会给出有用的信息。
接下来，把识别子加入到反应体系中。
识别子的英文叫“recognizer”，是能够识别特定的一种或几种 N 末端的氨基酸残基的蛋白。
在这篇论文中，作者说他们找到了三种识别子：
PS610 这种识别子，可以识别：F、Y、W，这三种 N 端的氨基酸残基。也就是：苯丙氨酸、酪氨基、和色氨酸，这三种氨基酸都是有苯香侧链的氨基酸。
PS961 识别子，可以识别：V、L、I，这三种氨基酸残基。也就是：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，这三种氨基酸都是有脂肪碳链侧链的氨基酸。
PS691 识别子，可以识别精氨酸，也就是“R”。
最近，在2023年7月份的一个研讨会上，作者 Brian 说他又找到了 2 种新的识别子：
一种可以识别甘氨酸和丙氨酸。
另一种可以识别天冬酰胺和谷氨酰胺。
这样，到现在止，这个方法可以识别 11 种氨基酸残基。
不同的识别子都被分别标上了不同的荧光染料，不同荧光染料的荧光特征被用于区分不同的识别子。
论文作者还在继续寻找新的识别子，所以未来这个方法将可以识别更多的氨基酸残基，一直到可以识别所有的氨基酸残基，甚至带有修饰的氨基酸残基。
为了区分不同的荧光染料所发出的光，论文作者在荧光时间上对它们做区分。
这两张图的横轴，是以纳秒为单位的时间轴。
纵轴是一个感光像素在不同的时间能检测到的电压，也就感光像素检测得到的信号。
绿色的尖峰，是感光像素是直接检测到的入射激光所带来的光信号。这个入射的激光是脉冲式的，一次只入射很短的时间，所以是一个尖峰。
后面这个先升高、后降低的这个峰，是荧光染料被激发后发出荧光，感光像素测到的信号。可以看到，在荧光染料刚被激发后，信号最强，而后逐步减弱。
图中，虚线标出的是有时间门限制后，接收的光信号。
注意上面这张图，与下面这张图，它们接收信号的时间范围是有差异的。
上面这张图是激发光照了之后，很快就开始收集光信号，是 Bin 1。
而下面这张图，是激发光照了之后，过 3 纳秒，才开始收集光信号，是 Bin 0。
它们两者之间有一个时间差。
作者定义了一个指标，叫“bin ratio”。bin ratio 是指 Bin 0 收集到光信号强度，与 Bin 1 收集到的光信号强度，这两者的比值。
不同的荧光染料有不同的 bin ratio。
这两张图展示了两种有不同荧光寿命的荧光染料，它们的荧光特点。
可以看到，左边的这个短荧光寿命的荧光染料，它的 bin ratio 值较小，只有0.26；而右边这个长荧光寿命的荧光染料，它的 bin ratio 值更大，可以达到 0.61。
每种荧光染料都有其特征的 bin ratio，所以可以跟据 bin ratio 的差异来区分不同的荧光染料。
接下来，我们来看，对于同一个识别子，如何区分它所识别的几种氨基酸残基。
每一种识别子，对它所识别的几种氨基酸的残基的结合牢固程度是不一样的，有的结合得更牢，有的结合得不牢。这就导致识别子结合到残基上之后，能够维持在结合的状态的时间长短是不一样的。
作者把识别子结合到某种氨基酸残基之后，能够持续结合的时间，叫作“pulse duration”,“脉冲持续时间”的意思，缩写成“PD”。
图中展示了 PS610 这种结合子，分别与三种氨基酸残基相结合，所能检测到荧光的情况。
横轴是时间。
我们可以看到，结合到 F 残基上之后，荧光峰的顶部往往较宽，也就是识别子与 F 残基的结合时间较长。
而结合到 Y 残基之后，峰宽会窄一些，也就是识别子与 Y 残基的结合时间较短。
再看结合到 W 残基上之后的情况，峰很尖，也就是识别子与 W 残基的结合时间很短。
最右侧的图，展示了识别子分别与三种残基结合的结合时间的长度，也就是“PD”，
分别是：2.49 秒、0.73 秒、和 0.31 秒。
也就是说，同一种识别子所识别的几种氨基酸残基，PD 时间长度是不一样的。它们分别给出的荧光信号，会在 bin ratio 和 PD 这两个维度上显示出差异。那么就可以通过这两个维度的差异，来区分多种氨基酸残基。
这张图，横轴是 PD，纵轴是 bin ratio。图中展示出了 4 种残基给出的信号
可以在两个维度上被区分开来。
更多种类的残基，也可以通过同样的方式被区分开来。
前面我们了解了如何识别一个氨基酸残基，接下来我们看如何连续地读出肽的序列。我陈巍给这种测序方式起个名字，叫“边降解边测序”。
在反应体系中加入针对蛋白质氨基端的外切酶、和各种识别子。
能识别第一个残基的识别子就会与第一个残基结合，在激发光的照射下，就会发出相应的荧光，并被检测到。
当第一个残基被外切酶切掉，第二个残基就会暴露出来，能够识别第二个氨基端残基的识别子就会结合到多肽的氨基端上。同样，在激发光的照射下，这种识别子上标记的荧光染料也会发出相应荧光。
再接着第二个残基被切掉，第三个残基暴露出来，并被识别子结合，并发出相应的荧光。
这样，经过多轮的切割、识别、再切割、再识别，就可以把肽的氨基酸序列识别来。
其中，当遇到没有识别子的氨基酸残基的时候，就会留出一段没有荧光信号的时间。
为了保证每个被识别子识别到的氨基酸残基，都能给出足够的荧光信号，作者控制蛋白外切酶的浓度，让每个氨基酸残基被切掉的时间，控制在大约 30 分钟左右。
上面这张图，是实测到的信号。
其中，有 5 段是有明确的识别信号的，被用彩色标出来。每一段被称为一个“recognition segment”，缩写为“RS”，“被识别出来的区段”的意思。
其间相隔了一些没有明确识别信号的时间段，被用灰色标出来，被称为“nonrecognition segment”，缩写为“NRS”，也就是“没有被识别出来的区段”意思。
下图，是软件用几个长方块标出了抽象后的信号。这些抽象出来的信号序列，就是测出来的部分肽序列。
第三部分，我们来说论文是提到实测中遇到的一些问题。
作者发现，决定氨基酸残基与识别子相互结合的 PD 值的，是多肽氨基端第一位的残基。但是，排第二、和第三位的残基，也会影响到 PD 值。
作者进一步研究发现，第二位、第三位的残基对 PD 值的影响，是符合经验规律的。因此，它们的影响可以在分析过程中，通过软件加以排除。
文章中提到的最长的测序距离是 18 个氨基酸，也就是图中所测到的 Y 这个氨基酸所在的位置。这说明，目前能够测出来的肽的长度还不算太长。
作者发现，随着残基离 N 端越远，它被切除所花的时间就越长，而且这是呈指数递增的。
以我陈巍的理解，这是因为反应体系中，蛋白外切酶的活性是随时间而递减的。所以离 N 端越远的残基，它被切到的时间就排在越后面，所以它被切掉所花的时间也越长。
这也是限制 Quantum-Si 测序长度的原因之一。
论文作者发现，当脯氨酸残基处于多肽氨基端的第二位时，多肽不能被所用的外切酶所切割。所以，当多肽序列中有脯氨酸的时候，切割就会停下来，信号一直停留在脯氨酸的前一个残基。
这张图，显示了蛋氨酸被氧化成蛋氨酸亚砜后，也就是硫原子被部分氧化后，原先能够识别蛋氨酸的识别子，不再能识别氧化后形成的蛋氨酸亚砜。
这说明，Quantum-Si 测序方法，是可以感知到蛋白质翻译后修饰变化的。
最后第四部分，来说一下我对这个方法的一些想法。
1. 高通量的蛋白质测序未来一定会有巨大的应用市场；
2. 对外切酶和识别子的改进将会大大提升测序的效率，包括第二位是脯氨酸残基时，外切酶切不动的问题；对蛋白翻译后修饰的问题，可以增加新的能识别修饰后残基的识别子；这些都是可以通过基因工程改造来实现的；
3. 可以考虑把感光元件、光路元件，从芯片中剥离出来，集成在仪器上。这样可以大幅降低芯片的成本。而感光元件集成在仪器上之后，就成了可以反复使用的部件，那整体上测序成本会大幅降低；
4. 用不同的荧光颜色来代替 bin ration，能更快、更好地区分识别子的种类。
以上是本次讲的全部内容，谢谢您的宝贵时间。
参考文献：Brian D. Reed, Michael J. Meyer, et al. Real-time dynamic single-molecule protein sequencing on an integrated semiconductor device [J] Science, 378, 186–192 (2022)
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