HBUT-China战队:神奇的魔法师——基因剪刀：CRISPR丨合成生物学竞赛

2023年合成生物学竞赛·创新赛第十七期《常规赛科普专题》文章来自湖北工业大学HBUT-China团队，题为“神奇的魔法师——基因剪刀：CRISPR”。

生命的奥秘隐藏在遗传物质DNA的四种碱基ATCG的排列组合之中。自沃森和克里克提出并证实DNA双螺旋结构后，人类从此就在破译生命密码的道路上披荆斩棘，勇往直前。现在随着分子生物学的飞速发展，对于基因的读、写、改都有了成熟的工具，人类对理解生命体，改造生命体的能力正处在一个飞速发展的阶段。

基因编辑技术就是对含有遗传信息的基因序列进行插入、删除、替换等修改的一种技术[1]，是目前应用非常广泛的一种创制变异的技术手段[2]。它就像一个分子剪刀，能够精确地剪切我们基因组中特定目标基因，使我们可以对目标基因进行修改，实现对特定DNA片段的修饰。当然你可以把它想象成一个电影剪辑师，他能够精确地剪切电影中不需要的镜头，并添加新镜头来改变电影的故事情节。同样地，基因编辑也能够精确地剪切我们不需要的基因，并添加新基因来改变我们身体内部发生的事情。

基于DNA核酸酶的基因编辑技术发展迅速，从第一代DNA核酸酶编辑系统ZFN、第二代TALEN到第三代CRISPR/Cas9系统，基因编辑效率不断提高、成本逐渐降低，应用范围不断扩大。

第一代基因编辑技术锌指核酸酶技术（ZFN），它就像是一个老式的剪刀，能够剪切基因，但是操作起来有点困难。你可以把它想象成一把生锈的剪刀，虽然能完成任务，但是需要花费更多的力气和时间。

ZFN由锌指蛋白（zinc finger protein，ZFP）和FokI内切酶的核酸酶结构域组成，前者负责识别，后者负责切割DNA。ZFP是自然存在的蛋白结构，其由锌指结构（zinc finger，ZF）组成，ZF能识别特定的3个连续碱基对，因此可通过串联ZF的数量调整ZFN的识别特异性。FokI通过N端与ZFP连接，以二聚体的形式发挥切割作用[3]。

图1. ZFN基因编辑技术[1]

第二代基因编辑技术转录激活效应因子核酸酶（TALEN）技术，它就像是一个升级版的剪刀，操作更简单，剪切效率更高。你可以把它想象成一把新买的剪刀，比老式剪刀更锋利，更容易使用。

TALEN的构造与ZFN类似，由TALE基序串联成决定靶向性的DNA识别模块，与FokI结构域连接而成。与ZF基序不同，一个TALE基序识别一个碱基对，因此串联的TALE基序与所识别的碱基对是一一对应的关系[4]。

图2. TALE基因编辑技术[1]

然而随着生命科学技术的快速发展，CRISPR/Cas9就如同一匹黑马横空出世，凭借其独特的优势，引起广泛的关注，应用于各大领域，就如同智能手机一般广泛应用于生活各个领域，而ZFN、TALEN就如同老式手机一样，虽然具有一样的功能，但是并没有智能手机更加方便快捷。

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，成簇规律间隔的短回文重复序列）是由细菌进化出来，抵御病毒的一种工具。CRISPR最早发现于细菌的免疫系统，当病毒入侵细菌时，细菌中的“防御警察”Cas蛋白会把病毒DNA的一部分剪下来，放入重复序列的间隔区，于是就形成了成簇的、规律间隔的短回文重复序列。

图3. CRISPR-Cas系统示意图

CRISPR-Cas系统包含两种重要的成分，一种是行使DNA双链切割功能的Cas蛋白，而另一种则是具有导向功能的sgRNA（single guide RNA）。简单来说，CRISPR-Cas技术就像是一个Offices上的“查找和替换”工具。科学家可以通过设计特异的RNA分子，使其能够识别并结合到基因组中特定的位置。然后，Cas蛋白会被引导到这个特定位置，同时对特定位置上的DNA进行切割。科学家也发现细胞可以利用自身的修复机制，对切割的DNA进行修复，从而实现对基因的编辑。

随着技术的进步，CRISPR也涌现出不同的种类，就像不同的手机品牌一样拥有不同的类型。

首先根据Cas蛋白的组成不同和效应复合物的性质，CRISPR/Cas系统分为2大类，即Class1和Class2。其中，Class1系统的效应复合物由4-7个Cas蛋白亚基组成，该类别的共同特征是利用多个Cas蛋白效应复合物实现干扰靶标核酸；而Class2系统的效应复合物则是单个多结构域蛋白，（如Cas9、Cas12等）实现编辑的作用。Cas9和Cas12a（Cpf1）在基因组工程上的应用，带来了生物技术上的变革。本项目中主要使用CRISPR-Cas12a系统，下面也将详细介绍CRISPR-Cas12a系统。

图4. CRISPR-Cas系统的分类[5]

CRISPR-Cas12a系统是一种基因编辑工具，有两个主要组成部分：sgRNA（Single Guide RNA）和Cas12a（也称为Cpf1）蛋白。

sgRNA（single guide RNA）是一个RNA分子，由三部分组成：crRNA、linker loop、tracrRNA。crRNA负责识别和结合目标DNA的特定序列；在实际操作中, 可以不需要linker loop[6]；而tracrRNA提供了结构支持，帮助sgRNA与Cas12a蛋白相互作用。因此sgRNA的设计是CRISPR-Cas12a系统中的关键步骤。

Cas12a蛋白是CRISPR-Cas12a系统的核心成分。它是一种RNA导向的DNA内切酶，能够根据sgRNA的指导，识别和切割特定的DNA序列[7]。Cas12a蛋白与crRNA结合形成复合物,复合物通过识别目标DNA序列的互补序列，将Cas12a蛋白导向到目标DNA上，并引发一系列的反应，包括切割目标DNA和激活其他DNA修复机制。

CRISPR-Cas12a系统运行的步骤：

1. Cas12a-crRNA复合物形成：crRNA的固定序列与Cas12a蛋白结合，并将Cas12a引导到目标DNA的特定位置上。

2. DNA的识别和切割：Cas12a复合物与目标DNA序列结合，Cas12a蛋白就会识别特定的DNA序列。

3. DNA修复与修改：目标DNA被剪切，细胞的自我修复机制可以介入修复断裂，通过提供修复模板，可以在修复过程中插入特定的DNA序列来实现基因编辑[8]。

形象地说，crRNA与Cas12a蛋白通过类似“榫卯”的方式紧密结合，“榫”与“卯”结构正确，二者便能够结合紧密。二者的作用也不同，crRNA像一张地图，指导Cas12a蛋白质去到找到正确的位置，Cas12a蛋白则是一把打开DNA这扇门锁的钥匙。简单来说，就是拿着地图(crRNA)和钥匙(Cas12a蛋白)，找到一个特定的锁(DNA)，将锁打开。

图5. CRISPR-Cas12a原理漫画

与其他CRISPR-Cas系统相比，Cas12a也具有一些优势，其中最重要的是它可以将编辑基因的效率提高到更高水平，并且可以在不同的细胞类型中使用。而且CRISPR-Cas12a的crRNA明显短于其他类型的CRISPR系统，二级结构也更加简单，这意味着设计、合成、转录crRNA将更加经济方便。同时CRISPR-Cas12a可以实现串联多个crRNA进行多基因靶向编辑，与单基因编辑效率相差无几[9]。且Cas12a核酸酶催化位点可自行处理pre-crRNA，不需要RNaseⅢ，弥补部分物种RNaseⅢ活性不高的缺陷，提高DNA切割效率[10]。

与最为常用的Cas9相比，Cas12a基因编辑系统拥有众多优势：

（1）Cas9剪切DNA需要两个小RNA分子，而Cas12a只需要一个；

（2）Cas12a酶分子量比Cas9小，进入细胞更容易，编辑成功率会提高；

（3）Cas12a系统不同的识别序列（TTN）令其基因编辑效果更好；

（4）Cas12a 切割 DNA 链产生 5nt5'端突出的黏性末端缺口，切割位点远离 PAM 位点，这将促进非同源末端连接和同源重组修复进行精确的基因替换；而 Cas9 产生平末端缺口，基因替换效率偏低[8]；

（5）Cas12a可以实现多基因编辑，其切割效率与单个crRNA的编辑效率相当；

Cas12a的PAM位点更加偏好5’-TTN，因此对比Cas9的富含G偏好性，更适用于基因组富含GC的物种，如紫色非硫光合细菌，会产生更低的脱靶率[11]。

表1 .两种CRIPSR编辑技术的比较[12]

CRISPR技术是在20世纪90年代初发现的，并在7年后首次用于生物化学实验，迅速成为人类生物学、农业和微生物学等领域最流行的基因编辑工具。

图6 .CRIPSR编辑技术的原理

现CRISPR技术广泛已经应用于基因编辑、基因疗法、精准医疗、农业领域。

在基因编辑方面，CRISPR / Cas系统已被迅速而广泛地用于靶向各种物种和细胞类型的基因组修饰，包括植物，昆虫，小鼠，兔子，猪，猴子，和人类细胞[13]。

图7. CRISPR系统漫画

在基因治疗方面，通过CRISPR技术来实现疾病的基因疗法：Yuxuan Wu 等人通过具有导致白内障的Crygc基因显性突变的小鼠注射Cas9 mRNA的受精卵和靶向突变等位基因的sgRNA达到治疗白内障的功效[14]。

同时CRISPR技术在各项疾病的治疗中也启到了重要作用（下图仅是导致癌症或其他遗传疾病的少数代表性突变[15]。）

表2. CRISPR技术在各项疾病重要作用[15]

虽然CRISPR技术具有无限的潜力，但是随着CRISPR技术的出现，对各种基因组进行靶向编辑不再是一个抽象的假设，而是定期发生的。由于CRISPR的应用领域超出了研究和生物医学疗法的范围，全球社会对系统使用的适当范围提出了新的和现有的伦理问题。CRISPR技术不断成熟，现有系统正在被设计为包含创新能力;令人兴奋的具有新颖功能的新型CRISPR系统仍在被发现。这种革命性工具的潜在好处是无穷无尽的。然而，像任何强大的工具一样，也存在引起道德问题的相关风险。为了对伦理争议领域做出真正明智的决定，需要控制良好、可重复的实验和临床试验[16]。

在未来CRISPR技术一定会在更加严格的行业要求下变得越来越成熟，同时为现有问题和疾病的解决提供新的思路和方向。

[1] 刘耀,熊莹喆,蔡镇泽等.基因编辑技术的发展与挑战[J].生物工程学报,2019,35(08):1401-1410.DOI:10.13345/j.cjb.180532.

[2] 姜奇彦,胡正,孙现军等.CRISPR-Cas9基因编辑的历史[J].科技传播,2020,12(20):1-5.DOI:10.16607/j.cnki.1674-6708.2020.20.003.

[3] Porteus, Matthew H, and Dana Carroll. “Gene targeting using zinc finger nucleases.” Nature biotechnology vol. 23,8 (2005): 967-73. doi:10.1038/nbt1125

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[5] Makarova, Kira S et al. “An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems.” Nature reviews. Microbiology vol. 13,11 (2015): 722-36. doi:10.1038/nrmicro3569

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