视频内容简介
Element公司的亲合子高通量测序技术，具有：
1、数据质量高
2、测序成本低
3、使用灵活性高
这3个优点。
本视频介绍了Element公司开创的“亲和子测序”化学原理，以及这种测序原理是如何让Element公司同时获得了上述的三种测序优势的。
视频字幕
大家好，欢迎来到【陈巍学基因】，今天我要给大家讲的是《Element 公司的亲和子高通量测序》
Element biosciences 公司亲和子测序有3个巨大的优势：
1、是它的测序数据的质量很高。它的实测数据中，80%的数据可以达到Q40以上的质量，90%的数据可以达到Q30以上的质量。而且，Element公司是我所知道的第一家提出把Q40作为数据质量标准的高通量测序公司；
2、它的测序成本很低。目前Element能给出的价格是每1个G的数据成本在5～6个美金，或者说35到42元人民币（测一个G的数据）。这个价格已经和用illumina公司的NovaSeq 6000型测序仪一般给到市场终端客户的测序价格一样了；
3、它的灵活性高。Element的AVITI测序仪的上机测序现在是1张Flowcell测300个G的数据。相比之下，能给出相同价格的NovaSeq 6000，它的主力测序芯片，也就是S4芯片的数据量，是一张芯片产3000个G。也就是说Element凑够300个G数据量就可以开一次机，而不是需要等凑够3000个G才能开机。
之所以element测序方法能有这么多优秀的特性，原因是它采用了全新的的化学原理，完全不同于传统的SBS，也就是“边合成边测序”的化学原理。
Element用的新化学原理是一种被称为“亲和子”测序的测序原理。
接下来，我们会分成三个部分来介绍Element的测序：
1、测序的化学原理
2、实用中的优势
3、未来可能的应用
我们先来说它的测序化学原理。
Element测序的过程，先把文库从线性DNA分子做成一个环化的单链DNA分子。
测序芯片上则是共价地结合了引物，这些引物也被称为“草皮引物”。
然后，把单链环状文库放到芯片上，环状文库的接头序列就会吸附到引物的互补序列上。
然后，加入聚合酶，在引物的引导下，聚合酶进行滚环复制。滚环复制的过程，会把要测序的目标序列的拷贝数增加一千倍左右。
滚环复制出来的DNA链，就像一团毛线团，这一团DNA是共价连接在芯片上的。
接下来，我们来看是如何检测DNA链的序列。
Element测序原理中，最重要的一点，是把用通过荧光信号检测模板上的碱基种类，与测序链的碱基延伸，这两个步骤拆分开来。荧光检测归荧光检测，碱基延伸归碱基延伸，拆分成两个步骤后，分别优化。
这里要重点介绍，Element公司设计的“亲和子”。
如图所示，亲和子这个化物的样子，它的中心是几个同一种颜色的荧光基团，向外伸出4根链，每条链的末端连着一个碱基，每一种亲和子上的4条链的末端所连的碱基是一样的。
一共设计了4种亲和子，每种亲和子各有一种荧光颜色，每种亲和子伸出去的链的末端各自连着一种碱基。这样，4种荧光颜色和4种碱基种类就分别对应起来了。
有了这4种亲和子，就可以把4种亲和子与聚合酶、引物都加入到芯片上。
我们可以看到，模板上的对应于引物接下来要延伸位置的，是一个A碱基。在聚合酶的配对作用下，亲和子末端的T碱基被配对到模板上A碱基所对应的配对位置上。
另一方面，因为亲和子上连的这个T碱基是有化学修饰的，所以它不能与引物发生聚合反应，所以延伸反应不能发生。
而一个亲和子伸出4条链，每条链的末端的那个T碱基，都会被吸附在这个毛线团上的某个引物末端要延伸的位置。这样，有了4重吸附力，整个亲和子就被较为牢固地吸附在这个毛线团上。
然后，进行清洗，把没有吸附到毛线团上的亲和子都洗掉，只留下能够吸附在毛线团上的亲和子。
那么所有留下来的亲和子，都是各个毛线团上引物延伸方向的下一个碱基所连的亲和子。
接下来，进行荧光拍照。
这是Element荧光拍照得到的有4种荧光颜色的照片。照片中的每一个光点，就是一个毛线团。每个毛线团都吸附了许多个亲和子，亲和子在激发光的照射下发出相应颜色的荧光。
因为是4种荧光分别对应4种碱基，所以，仪器就可以很方便地根据一个毛线团上所发出的荧光颜色，来判断这个毛线团上（要延伸的位置）相应的碱基种类。
在荧光拍照完成之后，先把吸附在毛线团上的亲和子都洗掉。
接下来，用带可逆终止基团的dNTP进行核酸链的延伸，是在dNTP的3’端有一个叠氮基团，这个叠氮基团起到了可逆终止的作用。
因为有这个终止基团，所以延伸步骤只会延长一个碱基。
然后，用化学试剂处理，把这个叠氮基团去除掉，露出3’端的羟基。
有了自由的3’羟基，这条链就可以继续延伸了。
为了更好地理解element的化学优势，我们先来比较一下element公司和illumina公司各自用的带修饰的单核苷酸。
我们可以看到，illumina用的修饰核苷酸，它的碱基上连一个长柄，长柄末端连着一个荧光染料。这个荧光染料就起到报告这个碱基是哪种碱基的作用。
这个长柄会在拍完照成之后，被用化学的方法切断。但是切断反应后会在碱基上留下一段残留的“柄”。
这张图，展示了illumina测序中切掉荧光基团之后，经过延伸的这条链上所残留下的柄。
测序行业把这些留下来的柄称为“scar”，“疤痕”的意思。很显然，这些残留下来的疤痕，让illumina测序中这根延伸的DNA链不再是天然结构的DNA链，而是多出了许多根额外的长柄。
这自然就会影响到illumina测序链的进一步延伸的效率。
我们回过来看Element用的dNTP，它没有伸出去的侧链，它在去掉了叠氮基团之后，就是一个自然的核苷酸。所以，Element测序过程中，延伸出来的链是自然的DNA链没有疤痕。
因此，Element的链在聚合酶的作用下，延伸的效率会更高。
这个动画，展示了SBS测序与亲和子测序，这两种方法带来的亲和力的变化，和试剂成本的变化。
左图是SBS测序，4个带着荧光基团的T碱基，在聚合酶的帮助下，与4条模板上的A碱基相结合。
但是，单个的核苷酸与模板的结合力较弱，单核苷酸很容易与模板解离。
为此，SBS测序中，要用1～10微摩尔浓度的核苷酸来进行反应。
这是一个较高的单核苷酸浓度，目的是用高的浓度来弥补修饰的单核苷酸与模板结合力的不足。
再看右图的亲和子测序，亲和子伸出4个链，4个链的末端的T碱基与模板的亲和在一起，4个亲和力叠加就会是一个很强的亲和力。
而且，就算有1、2个链松开了，也不影响整个亲和子还是吸附在这个毛线团上。
因此，亲和子测序中，只要10几个纳摩尔的浓度的亲和子，就可以进行测序了。
这样Element的测序直接把反应所用的核心化学试剂（带修饰的核苷酸）的浓度相比于SBS测序降低了约100倍。
这就是Element公司作为一家新的测序公司，一开始，就可以把测序的价格降到与Illumina成熟测序平台相似的价格的根本原因。
亲和子测序的第二个优势，是可以降低phasing和prephasing对测序数据准确性的影响。
Phasing是指部分延伸链的延伸步伐比大部分的延伸链慢了一个碱基，Prephasing则是指部分延伸链的延伸步伐比大部分的延伸链快了一个碱基。
左图，在SBS测序中，一个毛线团上的几个条延伸链，因为会有phasing和prephasing的情况发生，所以DNA链在延伸了几个循环之后，就会有少数的延伸链的末端的碱基与主流的链有不同步。
这些不同步的链所连上荧光碱基与主流链上的荧光修饰碱基的不同，就会造成信号的下降、噪音的增加。
这也是造成SBS测序在测序循环数增加之后，数据的准确性下降的主要原因，也是限制SBS测序长度的主要原因。
我们再看右图，在亲和子测序中，同样会有phasing和prephasing造成的部分链的延伸步伐与主流的链的步伐不同步。
但是这些不同步的链中，phasing的链只占全部延伸链的少数，prephasing的链也只占全部延伸链的少数。
而亲和子是有4条链，4条延伸链中就算有2条链上的碱基是A，1条是T，1条是G，结果我们可以看到，还是带有T的这个亲和子结合到了毛线团上。
这就是一种“选举效应”，也就是4种亲和子竞选，所有延伸链上吸附到延伸位置的碱基对4种亲和子进行投票，通过选票的多少来选出胜者。
最后是获得大部分选票的那种亲和子胜出，而只获得少部分选票的亲和子会输掉竞选。
“选举效应”会增强数量占大多数的那种碱基的胜出效果，弱化那些占少数的碱基的作用。
也就是说，选举效应会在一定程度上盖掉phasing和prephasing产生的噪音，同时突出主流链上的碱基信号，这是亲和子测序的数据质量高的原因之一。
Element的测序是可以做双端测序的，我去查了Element公司公开的专利，大致地了解了Element做双端测序的方法。
接下来，我就来给大家说一下我对它的双端测序方法的理解。
首先，在合成第一链的时候，是在4种正常碱基的dNTP之外，还掺入了dUTP（替代部分dTTP）。
U碱基在测序过程中，会被读成T碱基，所以，U碱基不影响对第一链的测序。
在第一链的测序完成之后，在反应体系中加入引物和phi29 DNA聚合酶，合成第二链。
因为毛线团中有多个引物结合位点的拷贝，所以引物会在多个位点起动互补链的合成，也就是形成多条第二链。而phi29酶的作用是后面的链可以把前面的链推开。
这样，可以保证最后只有一条第二链吸附在原来的第一链上。
接下来，在反应体系中加入USER酶，在第一链上有U碱基的位置产生切口，大量的切口就切碎了原来的第一链。
这里用到的USER酶，它的作用，是可以在带有U碱基的DNA链上，在U碱基所在的位置切出一个单链的缺口。
关于USER酶的文字介绍，我打在屏幕上了，有兴趣的同学可以暂停一下视频慢慢看，我在这里就不念了。
第一链被切碎后，碎片被洗掉。
然后，新合成的第二链通过与原始的草皮引物的互补关系，还是吸附在芯片上。
接下来，加入第二链测序的引物，再加入酶和亲和子，进行第二链的测序。
这就是Element实现双端测序的原理。
Element公司的另一项化学上的创新，是对芯片的表面经过了特别的处理，让芯片的表面变成低吸附的。这可以明显地降低检测过程当中的背景噪音，让信号可以被更好地检测出来。
第二部分，我们来说一下Element测序在实用中的优势。
Element测序的第一个优势，就是数据的质量很高。
Element公司公开承诺的数据质量，可以达到Q30以上的数据比例大于90%，Q40以上的数据比例大于80%。相比之下，illumina的NextSeq 2000的公开承诺的数据质量，是2X150的测序，可以达到Q30以上的数据比例大于85%。
我的几个同事和朋友，都已经实际用过Element进行测序，他们都一致表示：Element的测序数据质量很好。
第二个优点，是对于高GC含量和低GC含量的测序，能有更好的覆盖均一性。
这张图，横轴是把全基因组分成许多个测序窗口。把窗口按照GC含量，从低到高，进行排列；纵轴是均一化后，各窗口被覆盖的测序深度。
理论上，覆盖的这条线越平、越接近高度1，是越好的。
这里，蓝色的线是element的实测结果，黄色的虚线是illumina的实测结果。
可以看到，element的蓝线比illumina的黄色虚线，更加平，更加接近1。也就是说，element的测序结果，对高GC含量和低GC含量的区域的覆盖均一度是优于illumina的。
这在实用中会体现为对甲基化的文库更加友好。因为甲基化测序的文库当中，绝大部分的C碱基已经被转化成了T碱基，这会导致文库分子中GC比例极度偏低。Element的实测结果中，可以对甲基化测序文库得到较好的测序结果。
第三点，对同聚物序列的耐受性更好。同聚物序列，就是指一长串相同的碱基，比如连着10个甚至20个A碱基，或者连着10个、甚至20个T碱基。
这张图展示了连续12个相同的碱基之后，Illumina的NovaSeq测序仪的准确性、和Element的AVITI测序仪的碱基准确性。
横轴是以同聚物序列为中心，向左右两边延伸，纵轴是错配的碱基的比例。
我们可以看到，在illumina的测序结果中，在同聚物之后的序列中出现了较高比例的错配碱基。
而在Element的测序结果中，在同聚物之后的序列中，错配碱基的比例相比于illumina的要低许多。
所以，Element的测序对长的同聚物的耐受性更好。
第四点，Element的AVITI测序仪的测序速度较快。
AVITI这个测序仪一次可以测2张芯片，每张芯片产出约300G的数据，2张芯片一共产出600G的数据。
我去查了一下illumina和华大这两家公司的相似测序通量的测序仪的测序速度，在都测2X150的测序长度，都测几百个G的这个级别的数据量，AVITI这个机器用的时间是38小时，比另外两家的用时略短一些。
第五个优点，是Element测序的duplication率低，index hopping率也低。
Duplication是一个原始文库的分子在上机测序之后，产生了多条reads，这就叫“duplication”。duplication会浪费测序通量，是测序中应该尽量避免的。
左图是element与另两家主流的高通量测序公司的比较，可以看到element测序中的duplication率明显更低。
右图是index hopping的结果，也就是index序列和实际的文库插入片段的序列之间，产生了张冠李戴的问题。
右图是用一个大肠杆菌的文库，和3个人类样本的文库，放在一条lane里测序。
因为大肠杆菌的基因组序列与人的基因组序列有很大的区别，所以很容易从测序结果中找出index hopping的情况。
右图中显示，element的测序结果中，index hopping的比例远低于0.5%。这是一个很低的index hopping比例。
第三部分，我们来说一下Element测序未来可能的应用。
我看到了element的各项参数和性能之后，第一个想到的，就是它很适用于各种临床肿瘤样本当中的低频突变的检测。
比如：MRD，也就是白血病的微小残留病变；TMB，肿瘤突变负担；ctDNA，也就是血液中的循环肿瘤DNA。
这几项检测都是大海捞针的检测，有突变的reads可能只占全部测序得到的reads的几千分之一，甚至几万分之一。
1、element数据的高准确率，让检测肿瘤中的各种低频突变的准确率会大幅提高。
2、临床检测要求测得快，element的AVITI测序仪较快的测序速度，和它中等测序通量带来的不需要太多凑样，可以快速开机测序的优势，都可以加快交付测序数据的速度。
3、较低的测序价格，可以让医院有可能用得起element的测序服务。
4、低的index hopping的概率，也可以让医院、临检所可以更加放心大胆地用element测序来检测肿瘤样本，而不用太担心index hopping带来的错误index信息的张冠李戴的问题。
当然，在开展各项临床应用之前，Element还需要先通过国家的医疗器械认证。
以上，是本次讲座的全部内容。