肝细胞癌(HCC)是一种高死亡率的原发性肝癌，会经门静脉出现肝内播散，恶性程度高，易复发和转移。肝细胞癌也是最致命的三大恶性肿瘤之一。不过，随着研究的不断深入，肝癌中激活的肝星状细胞(aHSC)与癌症相关的成纤维细胞被认为是个潜在的治疗靶点。
单细胞RNA测序技术目前已广泛地应用到各个领域当中，包括了解不同组织类型、疾病状态、不同时期样本中的多种细胞亚群及其转录状态等，逐渐成为国自然热点研究方法。
而类器官技术在器官发育、精准医疗、再生医学、药物筛选、基因编辑、疾病建模等领域都具有广泛的应用前景。前不久，Nature称“类器官技术为生物医学技术的进步开辟了新道路”，也有越来越多的研究者将目光从动物身上转移至类器官这一国自然新秀身上。
那么，如何运用单细胞RNA测序和类器官这两大热门技术，来探索出这一恶性肿瘤的治疗新靶点，从而造福人类呢？
近日，来自美国的科学家们在Nature出版集团旗下刊物《Nature Communications》发表了题为” Hepaticstellate cell stearoyl co-A desaturase activates leukotriene B4 receptor 2 -β-catenin cascade to promote liver tumorigenesis”的研究论文，确定了肝星状细胞的12-HHTrE-LTB4R2-CTNNB1-YAP1通路是潜在的肝细胞癌治疗靶点。
本篇文章将单细胞测序、类器官与肝星状细胞联合起来研究，研究思路非常值得鉴赏和学习！
一、研究背景
HCC是第三大最致命的恶性肿瘤，而酒精性和非酒精性脂肪性肝炎等代谢性肝病目前被认为是HCC主要的诱发因素。
肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells, HSCs）是肝脏合成细胞外基质的主要细胞群，而肝损伤导致的HSCs激活、增殖及转化是肝纤维化过程中的重要环节。因此，HSCs在探讨新的抗肝纤维化治疗措施，对降低慢性肝病的发生率和死亡率具有不可估量的理论意义。此外，活化的肝星状细胞（aHSC）作为癌症相关成纤维细胞（CAF）促进了HCC的发展，然而其在HCC发展中的具体性质仍有待阐明。
二、研究方法
1. aHSCSCD2缺陷对YAP1的全面抑制
先前的研究表明，硬脂酰辅酶A去饱和酶2（Scd2）在aHSC中具有促肿瘤生长作用，而β-连环蛋白（CTNNB1）可以转录激活Scd2与其他蛋白相互作用。因此，为了验证小鼠在肝星状细胞中选择性消融Scd2（硬脂酰辅酶A去饱和酶）的作用，科学家们对小鼠肝细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。
结果发现，Scd2在内皮细胞、巨噬细胞、门静脉成纤维细胞（PF)、树突状细胞中都有表达，确定了表达其标记基因的不同细胞类型的簇。这意味着，Scd2消融在aHSC中具有相对选择性。
接下来，研究者通过对肝肿瘤邻近组织进行RNA-seq，探讨了aHSC Scd2缺陷的抗肿瘤作用的机制，利用差异表达基因（DEG）热图描绘了不同的转录组学景观，并通过免疫印迹（IB）进行分析。此外，研究者还通过免疫荧光（IF）显微镜检查了YAP1和细胞类型标记物的共表达，发现条件性敲除Scd2引起多种细胞类型中的CTNNB1失活。
2. CTNNB1对肝脏YAP1和SCD表达的调控
YAP1转录受CTNNB112正调控，YAP1和CTNNB1同时受到抑制，表示YAP1的抑制可能是由CTNNB1的减少引起的。于是，研究者想知道这种调节是否是肝脏肿瘤发生所特有的，还是与正常肝脏也有关。为此，他们分析了小鼠肝脏中主要在肝细胞和胆管细胞中缺乏CTNNB1的YAP1和Scd1/2的表达。
通过IB分析显示，肝脏中YAP1、TAZ、HuR和LRP6下调，同时CTNNB113和YAP1/ Wwtr1 mRNA的预期靶点Scd1/2也受到抑制。这表明，即使在正常肝细胞中，CTNNB1也能正向调节YAP1/ TAZ和SCD-HuR-LRP6通路。
3. aHSC SCD2缺陷会降低LTB4R2及其氧脂配体
SCD2是产生MUFA所必需的酶，MUFA通过延伸和去饱和作用产生多不饱和脂肪酸（PUFA）。因此，科学家们对Scd2f/f CC与Scd2f/f肝脏中的PUFA代谢物进行了脂质组学分析，发现Scd2f/f CC选择性减少了12-羟基七碳三烯酸（12-HHTrE）。
12-HHTrE是一种来源不明的17碳多不饱和脂肪酸，它是白三烯B4受体2（LTB4R2）的配体，涉及多种恶性肿瘤，但迄今为止均与HCC无关。本实验结果表明，aHSC SCD2控制LTB4R2及其亲和力最高的氧脂配体12-HHTrE的表达，并且LTB4R2激活可能抑制了Scd2f/f CC小鼠的肿瘤发生。
4. LTB4R2介导YAP1和CTNNB1激活
为了鉴定LTB4R2在HCC中的作用，研究人员检测了LTB4R2的药理学和遗传学抑制对人HCC细胞株Huh7生长的影响。
LTB4R2拮抗剂LY255283的浓度抑制Huh7的生长，而shRNA对LTB4R2的表达使其减少80%，但对LTB4R1 mRNA没有影响；证实了LTB4R2的促生长作用。
CTNNB1和YAP1是两种促进肝脏肿瘤发生的转录激活因子，LTB4R2 KD降低了细胞提取物中的YAP1，而GSK3β（丝氨酸/苏氨酸激酶）在LTB4R2 KD细胞中的抑制能力下调。以上表明，增加的GSK3β底物结合可能增强了CTNNB1蛋白酶体降解。此外，IF显微镜也证实LTB4R2 KD显著降低了nYAP1+，表明LTB4R2受体是正向调节。
5. 12-HHTrE通过LTB4R2和CTNNB1上调YAP1
2000年左右，LTB4R2被发现为LTB4的低亲和力受体，随后12-HHTrE被鉴定为高亲和力LTB4R2配体。研究者通过TEAD启动子荧光素酶测定发现，LTB4R2配体12-HHTrE激活TEAD启动子活性；但LTB4R2KD或与Super-TDU（一种YAP-TEAD相互作用的抑制剂）共同干预会失去这种效果。
IF和IB检测结果与LTB4R2抑制作用相反，强化了12-HHTrE-LTB4R2信号驱动YAP1和CTNNB1激活的概念。ChIP-qPCR分析显示：12-HHTrE在包含该TCF位点的区域和近端启动子区域（YAP-Y2），增加了CTNNB1和RNA聚合酶II（RNAPII）的共富集。此外，CTNNB1 KD消除了12-HHTrE诱导的YAP1 mRNA，表明CTNNB1在受体正向调节中的作用。
6. aHSC产生12-HHTrE以激活HCC中的LTB4R2-CTNNB1-YAP1信号
接下来，研究者探究了aHSC中的Ssd2如何通过LTB4R2通路支持HCC细胞中的YAP1激活。为此，科学家们用Ssd-shRNA（SCD-sh）转导的人aHSC LX2细胞与乱序shRNA（SCR-sh）的条件培养基（CM）处理了Huh7细胞。LX2 CM诱导的TEAD激活需要LTB4R2和YAP1，因为受体拮抗剂LY255283和Super-TDU消除了这种作用。使用脂质吸附试剂（Cleanascite TM）从<10kDa滤液中去除脂质会消除活性，表明脂质LTB4R2配体由aHSC依赖于SCD释放，以激活HCC细胞中的LRB4R2-YAP1通路。
进一步，研究者筛选了由scRNA-seq鉴定的细胞类型簇来检查TME中哪些细胞类型表达Cyp1b1，并分析可从NCI的肝癌单细胞图谱（scATlasLC）获得的人类HCC scRNA-seq数据。在人类HCCTME的不同细胞类型中，CYP1B1由CAF、TAM（肿瘤相关巨噬细胞）和TEC（肿瘤相关内皮细胞）表达。最终发现，TAM可能是人类HCCTME中氧化磷脂的主要来源，而CYP1B1可能是CAF中氧化磷脂的主要来源。
7. LTB4R2 KD再现条件性SCD2缺陷的肿瘤抑制
在处死小鼠后，研究者对LTB4R2的shRNA与乱序shRNA的AAV8载体来测试LTB4R2在体内肝肿瘤发生中的因果作用。如报告基因GFP表达所示，两种AAV8病毒载体均以约60%转导肝细胞。KD操作降低了肝LTB4R2蛋白和核CTNNB1和YAP1以及肝肿瘤中的LTB4R2 mRNA，而且似乎降低了肝脏重量/体重比，并显著抑制了肿瘤多样性和总肿瘤体积。这意味着，LTB4R2在CTNNB1和YAP1激活以及体内肝肿瘤发生中的作用。
8.转化的相关性检测
研究者进一步分析了 TCGA-LIHC队列数据，以检查每个 RNA-seq 的LTB4R2表达与患者存活率之间的关系。根据 CTNNB1 错义突变状态对患者进行了分层，并采用qPCR和IHC检测12-HHTrE 生物合成基因（PTGS2、TBXAS1、CYP1B1）、YAP1和LTB4R2基因变量。最后，研究者使用了患者HCC类器官来测试LTB4R2拮抗剂治疗和LTB4R2 KD的效果，发现了靶向12-HHTrE-LTB4R2通路抑制HCC生长的治疗潜力。
三、研究结果
研究者发现，选择性消融Scd2能够抑制CTNNB1和YAP1在肿瘤和肿瘤微环境中的激活作用，防止肝肿瘤的发生；同时，下调的LTB4R2及其高亲和力氧脂配体12-HHTrE也与肿瘤的抑制相关。此外，研究者通过单细胞RNA测序鉴定发现，aHSC以依赖于SCD和CYP1B1的方式释放12-HHTrE，其条件培养基在HCC细胞中重现了12-HHTrE的LTB4R2介导的肿瘤促进作用。在LTB4R2阳性HCC细胞附近检测到表达CYP1B1的aHSC，且患者HCC类器官的生长因LTB4R2拮抗或敲除钝化。总结来说，该研究结果表明，aHSC的12-HHTrE-LTB4R2-CTNNB1-YAP1通路是潜在的HCC治疗靶点。
四、总结
研究结果表明，aHSC中条件性消融Scd2会导致LTB4R2依赖性CTNNB1-YAP1通路的全局抑制，从而抑制肝肿瘤发生，LTB4R2拮抗或敲低验证了此结论。因此，肝星状细胞的12-HHTrE-LTB4R2-CTNNB1-YAP1通路是潜在的肝细胞癌治疗靶点。
这条通路是aHSC中Scd依赖性PUFA重编程的一种模式，它具有促进肿瘤的旁分泌作用，可能涉及肿瘤细胞和其他TME细胞类型中的类似重编程，并确定了Cyp1b1+亚群可能参与这种HCC促进转变。
参考来源：
Sinha S, Aizawa S,Nakano Y, et al. Hepatic stellate cell stearoyl co-A desaturaseactivates leukotriene B4 receptor 2 - β-catenin cascade to promote livertumorigenesis. Nat Commun. 2023 May 8;14(1):2651.
撰写：彤彤