无细胞蛋白质合成（Cell-Free Protein Synthesis, CFPS）亦被称为体外蛋白质翻译，是一种用于补充基于细胞内的蛋白质表达的技术。自2000年以来，全球无细胞领域研究进入快速发展期， 2020年全球相关专利和论文发表数量总计约3500篇，数量成倍激增。北美地区在该技术领域独占鳌头，拥有全球最大的无细胞表达产业链，占全球总市场份额55%。该领域知名公司包括Sutro Biopharma、Thermo Fisher Scientific、Promega、Takara Bio、New England Biolabs等。
自1961年CFPS技术首次被应用于破译DNA以来，大肠杆菌作为宿主的CFPS研究最多，蛋白表达量最高（图1）。除了大肠杆菌外，陆续有数十种细胞被开发成无细胞蛋白合成体系，如麦芽胚、兔网织红细胞、酵母、昆虫、CHO细胞等，合成蛋白产量从0.05 mg/ml到2.2 mg/ml。
图1.不同的CFPS合成蛋白的比较
CFPS技术过程首先是裂解培养的细胞，经过多步分离去除细胞碎片和基因组DNA，得到包含氨酰基-tRNA合成酶(AAS)、核糖体、延伸因子、转录起始因子等转录和翻译所必需的混合体系。该细胞提取物体系可在-80 °C保存数年，使用时只需要在反应前解冻，然后添加氨基酸、能量底物、模板DNA、辅因子、盐和核苷酸就可以合成目标蛋白。由于CFPS系统无需完整的活细胞就可以在体外受控环境中模拟整个细胞的转录和翻译过程，并允许对单个成分和反应网络进行详细深入的研究，因此有望克服细胞膜约束导致的表达局限性，在科学研究中具有广阔的应用前景。相比体内蛋白表达，无细胞系统具有操作简单、易于控制、开放特性等诸多优点，且不需要转化与转染，所以较胞内表达更加高效，能在几个小时内实现目标蛋白的合成（图2）。
图2.典型的无细胞蛋白合成反应
经过60余年的发展，无细胞体系已被成功应用到难合成的蛋白产品中，如膜蛋白、抗体、毒蛋白等高效合成中，并扩展到蛋白合成之外的众多领域，包括污水检测、病原体检测等（图3）。在医药研发领域，尤其是规模化应用层面，基于大肠杆菌裂解液的CFPS系统衍生的部分产品已经进入临床试验，例如靶向骨髓瘤和癌细胞中高表达的CD74和叶酸受体α（FolRα）的抗体偶联药物（ADC）就是Sutro Biopharma公司利用无细胞蛋白质合成平台XpressCF和基于非天然氨基酸引入的位点特异性偶联平台XpressCF+开发而成，展现了无细胞蛋白合成系统在医药领域的无限潜力（图4）。
图3.无细胞系统的应用领域
图4. Sutro 基于CFPS合成ADC的示意图
由于无细胞体系组份复杂，从头研发有一定难度。为了方便使用，海外代表性生物公司推出了商业化CFPS系统，如表1所示。
表1.全球代表性商业化CFPS系统
虽然商业化的CFPS试剂盒已问世，但成本较高仍是阻碍该技术应用普及的难点之一。在制备无细胞裂解物和反应组分方面，大量的成本来自于使用磷酸化能量系统、辅助因子、核苷酸、氨基酸和DNA等原料。CFPS合成的另一个难点是工艺放大问题，虽然2011年Zawada J.F.报道了100 L的线性放大，但除此之外其他放大的研究成果鲜见报道。
凯莱英合成技术研发中心（CSBT）一直关注合成生物学领域的前沿研发动向，经过多年的研发公关，已经突破众多实际应用中的重要技术难点，达到国际领先水平。研发团队通过对能量和反应体系的深入研究和优化，借助可替代的能量再生系统（如葡萄糖、麦芽糊精等）替代磷酸化底物，在整个合成反应过程中实现可持续的ATP再生。此外，在无细胞系统中使用单磷酸核苷而非三磷酸核苷作为核苷酸源，避免使用外源性tRNAs和环状AMP以降低氨基酸和核苷酸的浓度。经过系统性工艺优化与技术改进，目前1 L反应的原料花费显著降低，大幅节约开发成本。
在工艺放大领域，凯莱英研发团队通过公司内部多部门共同协作，自主研发设计反应装置，成功实现了从微升到升的线性放大，以参考蛋白GFP测试为例，5 h的产量可以达~5 g/L, 远高于文献报道水平，为无细胞蛋白工业化生产奠定了良好的基础。
凯莱英研发人员还创造性地将CFPS技术应用在酶库的高通量筛选及酶进化领域。由于酶液的高效制备是高通量筛选的关键限速步骤，因此凯莱英技术团队历经三代技术升级，利用CFPS技术针对小量的酶液实现高效制备，最终大幅提高生产效率。以制备200个酶为例，通过无细胞蛋白合成技术的应用，操作步骤从常规的11步降低至3步，人工节省50%，时间缩短了90%。伴随技术升级，酶液制备周期大幅缩短，不仅通量增大，筛选体积也逐渐缩小。凯莱英还同步建设高灵敏度、高通量的分析方法，为酶库的高通量筛选保驾护航。与此同时，依附于凯莱英先进的无细胞合成技术平台，团队将CFPS技术应用在酶进化的突变体构建及筛选中，并且在多个酶进化案例中进行了实践，将每轮进化的时间周期缩短了一倍以上，精准高效的获得了性状大幅提高的突变体。
在凯莱英开发的一种用于合成治疗偏头痛药物关键中间体的工程化转氨酶中，应用CFPS技术获得的最优突变体酶大幅提升了催化效率，成功实现了目标产物的公斤级放大生产。在另一项生物合成2’-F-2’-脱氧腺苷的反应中，利用CFPS技术将酶用量减少至原用量的1/20，反应时间缩短一半，成本也大幅降低至初始时的约四分之一，实现了大规模商业化生产，赢得客户高度赞誉及好评（图5）。
图5. 凯莱英利用CFPS技术合成2’-F-2’-脱氧腺苷
此外，伴随合成生物学研究的兴起，无细胞系统也被用于除蛋白质以外的生物大分子的合成中，如OriCiro Genomics公司（被Moderna收购）通过体外重构半保留半不连续的DNA扩增技术实现了质粒的高效合成，使得基因治疗和mRNA的合成更加便捷。
未来，作为一种新颖的生物制造方式，无细胞合成技术将在以凯莱英为代表的绿色制药技术企业的持续深耕中引领革新、绽放异彩！
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