2023年4月13日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）周斌研究组和诺华生物医学研究所Jan S. Tchorz研究组合作，在 Nature 子刊 Nature Genetics 上以封面故事发表了题为：Bipotent transitional liver progenitor cells contribute to liver regeneration 的研究论文。
该研究在人类多种肝脏疾病和小鼠肝损伤模型中鉴定出一群同时表达胆管上皮细胞和肝细胞特征的肝脏祖细胞；发现这群肝脏祖细胞起源于胆管上皮细胞；利用双同源重组示踪技术发现这群肝脏祖细胞具有向胆管上皮细胞和肝细胞分化的能力；通过基因敲除及过表达发现Notch和WNT/β-catenin信号通路分别调控胆管上皮细胞向肝脏祖细胞、肝脏祖细胞向肝细胞的分化。
成体肝稳态中，大部分肝细胞处于静息状态，增殖缓慢；当肝脏发生损伤后，肝细胞重新进入细胞周期，参与损伤修复，维持肝脏功能。近年来，越来越多的实验证明在肝脏损伤中，肝细胞具有显著的再生能力，肝损伤主要通过肝细胞的自我增殖进行损伤修复，而肝祖细胞对肝细胞的贡献几乎可以忽略。然而，在肝细胞中进行β1-integrin基因敲除或者p21基因过表达来抑制肝细胞的增殖，同时利用谱系示踪技术标记胆管上皮细胞，在肝损伤模型中直接观察到胆管上皮细胞转分化为肝细胞，促进肝脏损伤修复。
研究人员通过给予小鼠长期喂养TAA等药物来诱导慢性肝损伤，也观察到在慢性肝损伤过程中胆管上皮细胞可以转分化为肝细胞参与肝脏再生。随后，多个不同研究组独立证明在肝细胞增殖受阻的肝损伤条件下，胆管上皮细胞可以贡献给肝细胞参与肝脏损伤修复。以往的研究中由于诱导胆管上皮细胞向肝细胞转变的效率太低，很难进行细胞和分子机制的深入研究。关于胆管上皮细胞向肝细胞分化是否经历肝脏祖细胞状态这一细胞机制及胆管上皮细胞向肝细胞分化的分子机制尚未明确。
在该研究中，研究人员首先构建了高效稳定的胆管上皮细胞向肝细胞转分化的遗传学模型，为胆管上皮细胞向肝细胞转分化的细胞及分子机制研究奠定基础。研究人员在Fah基因中插入loxp-stop-loxp序列，构建了Fah-loxp-stop-loxp（Fah-LSL）小鼠，阻止Fah基因的正常表达。Fah-LSL小鼠与组织特异性CreER小鼠结合可以在特定类型细胞中发生Cre-loxp同源重组，切除stop序列，使细胞恢复表达Fah基因的能力。对CK19-CreER;R26-tdT;Fah-LSL/Fah-LSL小鼠进行他莫昔芬诱导，可将胆管上皮细胞及其子代细胞标记为tdT+，同时在胆管上皮细胞及其子代细胞中将Fah基因中的stop序列切除，使胆管上皮细胞及其子代细胞恢复表达Fah基因的能力。之后对小鼠停止给予NTBC药物，肝脏呈现严重损伤状态，刺激胆管上皮细胞向肝细胞分化。该遗传学模型从基因组水平进行全身性Fah基因敲除，不存在抑制肝细胞增殖的效率问题，因为每个肝细胞都是缺乏Fah基因的，这样能够高效稳定地诱导具有表达Fah基因能力的胆管上皮细胞向肝细胞转分化，为研究转分化的细胞和分子机制奠定基础。
在Fah-LSL/Fah-LSL小鼠诱导的肝损伤中，研究人员对Epcam+细胞进行单细胞转录组测序，结果显示Epcam+细胞群分为不同亚群；一群细胞高表达细胞增殖相关基因（Cdk1），定义为增殖的胆管上皮细胞群（Proliferating BECs）；一群细胞同时表达胆管上皮细胞分子标记（Krt19、Epcam）和肝细胞分子标记（HNF4a、Ttr），定义为肝脏祖细胞群（LPCs）。将上述单细胞转录组测序数据与之前报道的2组DDC诱导的肝损伤中Epcam+细胞的单细胞转录组测序数据进行整合分析，研究人员未在DDC诱导的肝损伤中检测到肝脏祖细胞；也未在正常肝脏中检测到肝脏祖细胞。同时，研究人员通过免疫荧光染色实验在Fah-LSL/Fah-LSL小鼠诱导的肝损伤中检测到CK19+HNF4a+的肝祖细胞，并且这些细胞也表达Epcam、A6、OPN等肝脏祖细胞分子标记；而DDC诱导的肝损伤中未检测到CK19+HNF4a+的肝祖细胞（图1）。此外，研究人员在多种人类肝脏疾病包括非酒精性脂肪性肝炎和病毒性肝炎等中发现肝细胞呈现衰老状态，并检测到CK19+HNF4a+肝祖细胞，发现肝细胞的衰老程度与肝祖细胞的产生呈现正相关联系；并且在这些人类肝脏疾病中，胆管上皮细胞未呈现衰老状态，提示在人的肝脏疾病中，胆管上皮细胞可能作为肝脏祖细胞的来源贡献给肝细胞而发挥重要作用。
图1：小鼠和人类肝脏LPC的鉴定
研究人员对单细胞转录组测序数据进行拟时序分析发现肝脏祖细胞来源于胆管上皮细胞；之后利用CK19-CreER工具小鼠标记并示踪胆管上皮细胞，揭示胆管上皮细胞可以贡献给肝脏祖细胞。为了研究肝脏祖细胞的分化潜能，研究人员利用双同源重组酶介导的谱系示踪技术来标记肝脏祖细胞（图2），示踪结果揭示肝脏祖细胞具有向胆管上皮细胞和肝细胞分化的潜能。值得注意的是，肝脏祖细胞不具有增殖活性，并且单个肝脏祖细胞不能同时产生胆管上皮细胞和肝细胞。
图2：利用双重组酶特异性标记肝脏祖细胞
单细胞转录组测序数据显示肝脏祖细胞群相较于胆管上皮细胞群下调表达Hippo信号通路相关基因和Notch信号通路相关基因，提示Notch信号通路调控胆管上皮细胞向肝脏祖细胞的分化。研究人员在胆管上皮细胞中进行Rbpj基因敲除，发现抑制Notch信号通路能够促进胆管上皮细胞向肝脏祖细胞分化，从而促进胆管上皮细胞向肝细胞分化（图3）。此外，研究人员利用Dibenzazepine药物来抑制Notch信号通路也证实抑制Notch信号通路能够促进胆管上皮细胞向肝脏祖细胞分化，从而促进胆管上皮细胞向肝细胞分化。当在胆管上皮细胞中激活Notch信号通路后，则完全抑制了胆管上皮细胞向肝脏祖细胞的分化，阻碍了肝脏再生。
图3：Notch信号通路抑制促进BEC形成TLPC
单细胞转录组测序数据显示胆管上皮细胞分化产生的肝细胞相较于肝脏祖细胞上调表达WNT/β-catenin信号通路相关基因，提示WNT/β-catenin信号通路调控胆管上皮细胞向肝细胞的分化。研究人员在胆管上皮细胞中进行β-catenin基因敲除，发现抑制WNT/β-catenin信号通路阻碍了肝脏祖细胞向肝细胞的分化（图4）；而在胆管上皮细胞中激活WNT/β-catenin信号通路能够促进胆管上皮细胞向肝脏祖细胞分化，促进胆管上皮细胞向肝细胞分化；并且在胆管上皮细胞中激活WNT/β-catenin信号通路后促进肝脏祖细胞中肝细胞基因以及肝细胞代谢相关基因的上调，提示激活WNT/β-catenin信号通路能够促进肝脏祖细胞向肝细胞分化。此外，研究人员利用RSPO1重组蛋白来激活WNT/β-catenin信号通路，也能够显著促进胆管上皮细胞向肝细胞分化。
图4：抑制Wnt信号通路阻碍BEC形成肝细胞
以上研究揭示了胆管上皮细胞转分化为肝细胞的细胞及分子调控机制，发现双潜能肝脏祖细胞促进肝脏再生的机制（图5），为肝脏祖细胞诱导产生肝细胞治疗肝脏疾病的临床转化应用提供新的理论基础和研究思路。
图5：双潜能肝脏祖细胞促进肝脏再生机制。a, 示意图显示肝脏祖细胞起源于胆管上皮细胞，并在肝脏再生中贡献给肝细胞。肝脏祖细胞是双潜能的，可以分化为肝细胞或胆管上皮细胞，但是一个肝脏祖细胞不能同时产生肝细胞和胆管上皮细胞。b, 示意图显示抑制Notch信号能促进胆管上皮细胞向肝脏祖细胞分化，激活Notch信号则抑制这一分化过程而促进胆管上皮细胞增殖。c, 示意图显示抑制WNT信号削弱肝脏祖细胞向肝细胞分化，激活WNT信号会促进胆管上皮细胞向肝脏祖细胞和肝脏祖细胞向肝细胞的分化。
中国科学院分子细胞科学卓越创新中心周斌研究组副研究员蒲文娟和博士生朱欢、张铭珺为该论文的共同第一作者，周斌研究员和诺华生物医学研究所Jan S. Tchorz博士为该论文共同通讯作者。该研究得到瑞士巴塞尔大学Heim Markus、意大利IRCCS Humanitas大学Luigi Terracciano等大力支持和帮助。该工作得到中科院、基金委、科技部和上海市科委等部门的经费资助。
论文链接：