视频内容简介
PASTE 技术是基于 PE 基因编辑技术的一种新的基因编辑技术。PASTE 可以把大片段的 DNA 整合进细胞基因组，并且不使用 DNA 双链断裂的方法。因此，PASTE 引起的意外 indel 的概率较小。
目前，PASTE 已能做到把 3.6 万个碱基对的长片段插入靶基因中。
并且，科学家已实现了通过腺病毒载体用 PASTE 方法对活体小鼠身上的细胞的做基因编辑。
视频字幕内容
大家好！欢迎来到【陈巍学基因】，今天我给大家讲一项新技术，在《细胞中插入长基因片段的新技术 PASTE》
今天，我们要讲的内容，分4个部分：
1、文章概要
2、实验原理
3、实验结果
4、分析小结
我们先说第一部分，文章概要
原文的标题是《Drag-and-drop genome insertion of large sequences without double-strand DNA cleavage using CRISPR-directed integrases》，文章发表在 nature biotechnology 杂志的 2022 年的 11 月刊上。
文章题目，直译成中文，意思是《使用 CRISPR 定向整合酶在不进行双链 DNA 切割的情况下拖放大序列插入基因组》。
论文中展示了一种新开创的技术：PASTE 技术，这是 programmable addition via site-specifc targeting elements 的首字母缩写。
第二部分，我们来讲实验原理
这是实验方法的原理图。
实验中的第一步，是做一次 Prime Editing 的基因编辑。
Prime Editing 的首字母缩写是“PE”。
想对PE方法有深入了解的同学，可以在网上找一下我做的【陈巍学基因】《用 prime editing 做基因编辑》的视频，在那个视频中，我详细地讲解了PE方法的工作原理，以及科学家对 PE 方法的多种改进。
我们回到实验原理。
实验设计中的第一步是设计一个新的融合酶。
这个酶分三部分，最下面这部分，就是 PE 中用到的基因改造过的 Cas9 酶，这个改造过的 Cas9 酶保留了能够与 guide RNA 结合的能力，并且保留了切断 DNA 的一条链的能力，但是失去了切断 DNA 第二条链的能力，这就避免了对 DNA 造成双链切割。
中间这部分是PE中用到的 M-MLV 逆转录酶，它的作用是以被引入的 RNA 为模板，来逆转录合成 DNA 序列，新合成出的 DNA 链将被编辑进基因组 DNA 中
最上面的这部分，是一个Bxb1整合酶。它的作用是可以把一大段基因序列插入到一个特定的靶序列中。Bxb1 这类的整合酶，主要是在噬菌体中被发现，在自然条件下它的作用是把噬菌体的一大段基因序列插入到宿主细菌的基因组中的特定序列中去。
整合酶在这个融合酶里所起的作用，是把大段的 DNA 片段插入到基因组中特定的靶基因位置中去。
回到实验方法的原理图。
这个 atgRNA，就相当于PE反应中的 pegRNA，论文作者专门给它重新起了个名字，叫“atgRNA”, 是 attachment site-containing guide RNA 的首字母缩写。
在这个 RNA 里，带了要插入基因组中的一段序列。也就是 attB 序列，attB（序列）是 Bxb1 整合酶把目标 DNA 序列要插入的那个靶序列。
这个实验中，作者挑选的靶基因，是β肌动蛋白基因的第一个外显子。
经过 PE 反应之后，这个 attB 序列就被插进了细胞基因组的靶序列位置，。
接下来，Bxb1 整合酶，就会把目标基因序列，也就是图中棕色三角，attP序列，和它所带的后面这段基因，整合进这个 attB 位置。
整合完成之后，就达成了把大段的基因序列插入目标位置的效果。
第三部分，我们来讲实验的结果
作者尝试了一系列的 PASTE 酶的构造，来提升把大片段 DNA 整合进基因组的效率。
图上左上角的，是这个PASTE酶的基因构造，横轴和纵轴列出了作者对许多种可优化因素做的各种尝试。
最后的结果，是整合的效率最高能够达到接近 30%。
然后，作者又尝试用 PASTE 方法把 GFP 基因插入不同的靶基因，看表达的结果。这里是分别插入 4 种靶蛋白。
GFP蛋白能在紫外光照射下发出绿色荧光。蓝色的（荧光）是 DAPI 的染色，红色的免疫荧光显示的是是那个靶基因所表白蛋白。
左上角，是把 GFP 转基因进了β肌动蛋白的基因，β肌动蛋白是细胞骨架。三种荧光的合并图中，可以看到绿色荧光出现在细胞骨架中。
再看其它三个例子，靶基因NOLC1 的蛋白是定位在核仁的蛋白
SRRM2 是定位在细胞核的蛋白；
LMNB1是定位在核膜的蛋白；
我们可以看到，这三个例子，转基因后 GFP 的绿色荧光都出现在目标蛋白原来细胞定位的位置。
这说明，一、PASTE 方法可以把 GFP 基因整合进靶基因，并且 GFP 基因和靶基因是在同一个翻译阅读框中，翻译出的蛋白保持了 GFP 发出绿色荧光的功能。
二、这四个被分别插入了 GFP 基因片段的靶基因，翻译出的蛋白，在蛋白产物的定位上，蛋白产物还是出现在靶基因原来应该出现的亚细胞结构的位置。
然后，作者做了PASTE方法与另两种插入大片段方法的整合效率和发生意外 indel 的比较。
HITI方法，全称是 homology-independent targeted insertion.
HDR 方法，全称是Homology-directed repair。
中间和右边的两张图，是比较三种基因整合方法的结果，
比较的内容是：1、编辑效率，用蓝色柱子表示；2、发生 indel 的比例，用白色柱子表示。
从图中我们可以看到，PASTE 方法的编辑效率高于另外两种方法，同时发生 indel 的比例低于另外两种方法。
接下来，作者又测试了在插入一个片段的同时，从靶基因上切掉一段是否可行。
从靶基因上切掉一段的原理如左图所示。在要切掉的片段两侧分别设计 pegRNA，然后两侧都发生PE编辑的过程中，左右两侧一粘上，就会把中间的片段去掉了。
实验的结果，在插入片段的同时，可以从靶基因序列上切掉130BP的片段，切掉的效率约为8%；另一个切除 385BP 片段实验的效率可以达到 10% 以上。
接着，作者尝试了在一次实验做多重的基因片段插入。
左图，是在β肌动蛋白的基因中插入发绿色荧光的 GFP 基因，并同时在核仁磷酸蛋白基因，NOLC1基因中插入发红色荧光的 mCherry 基因。
结果可以看到细胞骨架处发绿色荧光，核仁中心处发出红色荧光。这与两个靶基因原来在亚细胞结构中的定位是一致的。
右图，是在β肌动蛋白的基因中插入发绿色荧光的GFP基因的同时，并同时在核纤层蛋白基因，LMNB1 基因中插入发红色荧光的 mCherry 基因。
结果，可以看到细胞骨架处发绿色荧光，而在核膜处发红色荧光。这与两个靶基因原来在亚细胞结构中的定位也是一致的。
作者尝试用 PASTE 方法向基因组中插入长的大片段，结果可以把长达 3.6 万个碱基的长片段整合到基因组中，并且整合的效率达到 10% 以上。
作者尝试把 PASTE 的所有组件都用病毒载体来转染进细胞。把三个组件分别装进三个腺病毒载体。
Cas9 酶和逆转录酶的融合酶，装进第一个腺病毒载体。
把 Nicking gRNA、atgRNA、和整合酶 BxbINT 装进第二个腺病毒载体。
把要整合进基因组的 EGFP 基因装进第三个腺病毒载体。
然后，把这三种腺病毒同时转染两种培养的细胞。
结果在这两种培养的细胞中，都得到了 50～60% 的整合效率。
然后，作者在活的小鼠体内，做 PASTE 的基因整合的试验。
动物模型是选用带有人的肝细胞的小鼠，这个小鼠肝脏中人的肝细胞的比例 ≥70% 。
作者把前面说的三个腺病毒载体的混合物对小鼠做眼眶后注射，在4周之后取小鼠的肝脏进行基因检测。
发现肝脏中人类肝细胞中，最高有 2.5% 整合进了外源基因。
这个实验说明 PASTE 方法，能对活体动物进行细胞基因改造。
第四部分，我们做一下分析小结
1.PASTE 方法从 PE 方法的基础上进一步发展，达到了一次能把长达 3.6 万个碱基的长片段整合进基因组的水平。 PASTE 方法保持了 PE 方法较少引起意外的 indel 突变的优点；
2.PASTE 方法能在把目标片段整合进基因组的同时，从靶基因上切掉大段的片段，达成基因片段替换的效应；
3.PASTE 方法可以同时对几个靶基因位点分别做不同的片段整合；
4.PASTE 方法可以用腺病毒载体把三个元件运进细胞，进行整合。并且已经在小鼠体内完成基因整合的实验。
通过微流控技术，得到单细胞的乳浊液，再用带DNA标签链的微珠对单细胞中的目标DNA片段加上标签序列。
目标序列被靶向扩增后，用高通量测序可以分析出每个单细胞中的目标基因的变化情况。
因此 mission bio 的这项单细胞 DNA 测序技术，已经被多家做基因治疗的公司用作检测基因编辑效果的工具。
细胞在经过基因编辑后，可能会变成编辑过的纯合子，也可能变成杂合子，还有很大一部分细胞保持野生的状态。
另外，基因编辑还往往遇到要同时对多个基因进行编辑的情况。
Mission bio的单细胞DNA测序，可以很好地对基因编辑后的细胞的基因型，做精确到单个细胞的检测。
Mission bio 还能对基因编辑中，预测可能发生的脱靶编辑的位点进行检测，并且检出的灵敏度极高。
逆耳生物公司是 mission bio 公司在中国的特约服务商，提供基于 mission bio 公司技术的单细胞 DNA 测序服务。
参考文献：