随着单细胞技术的快速发展，能够定义更多不同分子类型的神经元，这对于解析神经环路功能具有重要意义。但是单细胞测测序定义的细胞类型缺乏空间位置信息。2018年光遗传学主要发明者斯坦福大学Karl Deisseroth教授开发了三维空间的大脑原位单细胞测序技术能够获得某个组织中细胞类型的空间分布和基因表达图谱，解决了上述问题。
在特定行为过程中将特定类型的神经元与其功能联系起来需要实现在体内监测该细胞类型的活动。一般来说，可通过工具小鼠标记特定细胞类型实现功能解析，但标记的细胞类型个数有限（1到3个分子标记）。
2022年1月7日美国波士顿大学Jerry L. Chen研究团队将双光子钙成像技术和多轮原位杂交实验结合形成CRACK技术，实现了解析多个细胞亚型与行为学功能的关联。
图1：CRACK技术流程
简单的来说，首先在行为过程中通过双光子显微镜实现对不同深度的组织进行钙成像，记录神经元钙离子变化（成像区域内所有神经元群活性）；其次，通过透明脑技术结合mRNA探针原位杂交实现三维空间上的细胞类型定位，定义特定分子类型的神经元（成像区域内特定分子细胞类型的神经元活性）；最后，利用条形码读取方案解码与行为相关的新的细胞类型(图1）。
图2：胡须触觉空间记忆任务流程
研究人员利用基于胡须触觉空间记忆任务，该实验使用旋转转子将小鼠胡须向前或向后偏转（图2）。实验过程中首先给与 “sample”刺激，随后是 2 秒延迟期，最后给与 “test”刺激。若“sample”刺激与“test”刺激引起胡须偏转方向相同舔舐水管给与水奖赏；反之，若上述两个刺激引起方向不同，则不舔舐水管。
基于之前的单细胞测序结果，他们将初级体感皮层第2/3层（S1 L2/3）区域的兴奋性神经元细分为Adamts2、Baz1a、Agmat三种亚型，将抑制性神经元细分为Lhx6阳性神经元、血管活性肠肽受体 2 (Vipr2)阳性小清蛋白能神经元、软骨凝集蛋白（Chodl）阳性生长抑素能神经元和类甲状旁腺激素（Pthlh）阳性血管活性肠肽能神经元。
通过将上述亚型兴奋性和抑制性神经元钙离子变化与上述任务的实验变量（刺激类型、方向、选择过程等因素）进行相关性分析，结果发现Baz1a兴奋性神经元和Pthlh阳性血管活性肠肽能神经元主要编码与胡须移动（即触觉）相关的信息。
图3：病毒示踪实验揭示Baz1a兴奋性神经元的输出
上述多种亚型细胞与触觉空间记忆任务实验变量构成复杂的网络功能连接，发现Baz1a兴奋性神经元在协调上述整体网络活动中发挥最为主要的作用。进一步通过病毒示踪实验发现S1 L2/3区域Baz1a兴奋性神经元主要投射到该区域的生长抑素能神经元。
总的来说，本文通过CRACK技术发现Baz1a兴奋性神经元作为多个分子类型的神经环路网络的关键节点，处理感觉信息。
CRACK技术的出现可解决单细胞测序技术定义分子类型却不能定义功能的痛点，极大的推动神经科学发展。当这种技术与程和平院士研发的自由运动状态的微型双光子显微镜技术结合后，也能够拓展到更多的行为学功能研究，碰撞出更大的“钙火花”。
【参考文献】
1.https://doi.org/10.1126/science.abl5981
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